3.3.9圆二色性（Circular dichroic，CD）测定
1%(w/w)的蛋清溶液调节到pH 4.0，6.0，10.0，在85oC加热不同时间，离心，取上清液，然后稀释至100~200μg/mL溶液。

对照组为天然蛋清样品。

用Jasco J-715光度计测定样品的CD谱。

测定条件设定：测定波长范围190~250 nm，25oC，比色皿光径1 mm，分辨率0.2 nm，扫描速率100 nm/min，扫描5次。

使用Jasco SSE软件确定样品的二级结构百分含量。

3.4.6蛋白质的二级结构对DH的影响
蛋白酶的水解反应还受到蛋白质的结构的影响，一般结构紧密的蛋白质提供的酶切位点少于结构松散的蛋白质。

因此有必要研究蛋白质结构对DH的影响。

蛋白质的热处理可能引起二级、三级和四级结构的变化。

从二级结构看，α-螺旋结构表现蛋白质分子的有序性，而其结构如β-折叠、β-转角、无规卷曲等反映了蛋白质分子的松散性[26]。

蛋白质分子的有序性差，越有利于蛋白酶的水解。

目前，研究蛋白质构象最好的方法是x-射线衍射，但对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说，制备蛋白质单晶较为困难。

二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下蛋白质分子的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂。

相比之下圆二色性是研究稀溶液中蛋白质分子构象的一种快速、简单、较准确的方法。

圆二色性在紫外区段(190~240 nm)，主要生色团是肽链，这一波长范围的CD谱包含着生物大分子主链构象的信息。

在一般情况下，实验中得到的CD谱线是α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构象的CD 谱的线性迭加[27]。

图3-7显示天然蛋清的CD谱线a在222 nm处和208 nm处呈负峰，在190 nm附近有一正峰，这是存在部分α-螺旋构象的特征。

谱线b、c、d、e在221 nm处的负谱带减弱，意味着α-螺旋的百分比减小。

谱线b、c、d、e向短波长方向移动，即发生蓝移。

由于发色团吸收光谱发生位移主要取决于它的微环境更加亲水或疏水的结果[28]，因此谱线b、c、d、e蓝移的发生说明体系的亲水性降低,即疏水性增加。

表3.3列出了天然蛋清和热处理蛋清的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲构象所占的比例。

从表中可以看出，通过热处理，天然蛋清的α-螺旋比例下降，而β-折叠和无规卷曲的比例增加，说明蛋清蛋白分子结构的有序性降低，形成了以β-折叠和无规卷曲为主的二级结构。

图3-7天然和热处理的蛋清的CD光谱
a-天然蛋清；b-pH4，85oC加热36 min蛋清；c-pH6，85oC加热36 min蛋清；d-pH10，85oC 加热30 min蛋清；e-pH10，85oC加热60 min蛋清。

4.19圆二色谱分析动态超高压微射流均质对卵清蛋白二级结构的影晌
圆二色光谱(简称CD)是目前应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。

它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。

而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中186]。

蛋白质是由氨基酸通过肤键连接而成的具有特定结构的生物大分子。

在蛋白质中，氨基酸的a一碳原子是不对称碳原子，具有光学活性，蛋白质的肤链走向也是不对称的结构，也具有光学活性，当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生了吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。

通过测定蛋白质溶液的圆二色性，可以研究蛋白质的二级结构及其变化信息[87一l。

一般蛋白质的圆二色光谱分为两段，波长范围在185一245Inn 称为远紫外区，245一320nln称近紫外区。

具有不同二级结构的蛋白质或多肤所产生的CD 谱带的位置、吸收的强弱都不相同。

a一螺旋结构在靠近192Inn有一正的谱带，在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带;p一折叠的CD谱在216nm有一负谱带，在185一Zoonln有一正谱带;p一转角在206lun附近有一正CD谱带。

远紫外区是蛋白质肤链的吸收峰，反映了主链的构象。

因此，可利用这一区域的CD光谱推算蛋白质分子中的a一螺旋、p一折叠、p一转角以及无规卷曲的含量191]。

本实验利用圆二色光谱分析经动态超高压微射流均质处理后的卵清蛋白的二级结构变化情况。

下图分别为经不同均质压力处理后的卵清蛋白的圆二色谱图。

图4.24未处理的卵清蛋白的CD色谱
图4.2540MPa卵清蛋白的CD色谱
图4.2680MPa的卵清蛋白的CD色谱
图4.27120MPa的卵清蛋白的CD色谱
图4.28160MPa的卵清蛋白的CD色谱
图4.24一图4.28分别为不同压力处理的卵清蛋白与对照组的CD谱。

可以看出，不同压力对卵清蛋白CD谱的影响程度不同。

与未处理的样品相比，经不同压力处理后卵清蛋白CD 谱曲线，谱峰峰位和峰高均发生了不同程度的变化。

由图4.22中可知，未处理的卵清蛋白样品的CD谱在208nm和222nm附近处有两个宽负峰谱带;在190一202lun有一正谱带。

从各谱峰位及峰形来看，说明卵清蛋白以多种构象共存，并以a一螺旋结构为主。

经不同压力处理后，在192run出现明显的正峰谱带，并且在192tun和222nm处峰强有所提高，而在190nm处，峰强减小，这说明经高压均质处理后卵清蛋白的a一螺旋的含量有所增加(这与红外光谱的结果相一致)，p一折叠有所减少。

将CD图谱与、认ng氏参照CD光谱拟合后估算出卵清蛋白二级结构中a一螺旋，p一折叠，p一转角和无规卷曲所占的比率。

.圆二色谱的结果表明，动态超高压微射流均质使卵清蛋白的二级结构发生了变化。

a一螺旋含量增加，既a一螺旋结构有所展开，并发生去折叠现象。

且过高的压力使卵清蛋白的a一螺旋和p一转角又向p一折叠转化。

(10)圆二色谱分析
用JASCOJ一810旋光仪旧本JASCO公司)测定卵清蛋白的远紫外圆二色谱变化170]。

旋光仪与电脑连接以Jasco软件操作。

将经过处理后卵清蛋白溶液注入0.Icm厚的椭圆形比色皿中，在25℃和连续充氮的条件下，进行远紫外区域190一250nm)扫描，速度为50nln/min，光谱间隔0.Inln，3次累积。

由仪器提供的、认ng氏参照CD光谱估算卵清蛋白二级结构中a螺旋，p折叠，p转角和无规卷曲所占的比率。