圆二色光谱实验
一、实验目的
1、了解圆二色（CD）光谱的原理和使用方法。

2、学会用圆二色光谱检测蛋白质二级构象的基本原理和方法，并学会分析物质的手性。

3、了解圆二色光谱仪的基本构造，并学会使用。

二、实验原理
1.CD光谱的基本知识
圆二色性是研究分子立体结构和构象的有利手段。

在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。

电矢量相互垂直，振幅相等，位相相差四分之一波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。

平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二色性。

圆二色性用摩尔系数系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM = εL –εR，其中，εL 和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。

如果εL –εR >0，则ΔεM为“+”，有正的圆二色性，相应于正Cotton效应；如果εL –εR<0，则ΔεM为“-”，有负的圆二色性，相应于负Cotton效应。

由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此从圆偏振光通过介质后变成了椭圆偏振光。

圆二色性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。

[θ]和ΔεM之间的关系式：[θ]=3300*Δε
圆二色光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二色谱仪测定。

一般仪器直接测定的是椭圆度θ，可换算成[θ]和ΔεM：[θ] = 100θ/cl，ΔεM= θ/33cl 其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。

输入c和l的值，一般仪器能自动进行换算，给出所需要的关系。

2.定性分析原理
圆二色光谱仪需要将平面偏振调制成左、右圆偏振光，并用很高的频率交替通过样品，因而设备复杂，完成这种调制的是电致或压力致晶体双折射的圆偏振光发生器（也称Pocker池或应力调制器）。

圆二色谱仪一般采用氙灯作光源，其辐射通过由两个棱镜组成的双单色器后，就成为两束振动方向相互垂直的偏振光，由单色器的出射狭缝排除一束非寻常光后，寻常光由CD调制器制成交变的左圆偏振光、
右圆偏振光，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接受检测。

测试时要通入氮气赶走管路中的水蒸气和光源产生的臭氧（臭氧会腐蚀反射镜）。

光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同，其光吸收的差值ΔA ( Al - Ad) 称为该物质的圆二色性(circular dichroism，简写作CD) 。

圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光，且只在发生吸收的波长处才能观察到。

所形成的椭圆的椭圆率θ为：θ= tg- 1（短轴/长轴）
根据Lambert-Beer 定律可证明椭圆率近似地为：θ= 0.576 lc (εl - εd) = 0.576 lcΔε 公式中l 为介质厚度，c 为光活性物质的浓度，εl 及εd分别为物质对左旋及右旋圆偏振光的吸收系数。

测量不同波长下的θ(或Δε) 值与波长λ之间的关系曲线，即圆二色光谱曲线。

在此光谱曲线中，如果所测定的物质没有特征吸收，则其Δε值很小，即得不到特征的圆二色光谱。

当εl >εd 时，得到的是一个正的圆二色光谱曲线,即被测物质为右旋；如果εl <εd ,则得到一个负的圆二色光谱曲线，即被测物质为左旋。

三、实验试剂和仪器
试剂：D/L-丙氨酸；蒸馏水
仪器：J-815CD Spectrometer；1cm比色皿*2
四、实验步骤
1.样品制备。

实验所需样品由助教提前制备好待用。

2.开机。

打开高纯氮气，通入光路。

打开计算机，进入操作界面，设置相关参数开启氙灯，等约30 min，待仪器充分预热后，方可使用。

3.测试
将光路径为1 cm的样品池放入样品室中，进入测试界面，输入测试参数：灵敏度1000 mdeg；扫面范围350-200 nm；扫速50 nm/min；响应时间2 s；响应波长宽度1.0 nm；扫描次数1次。

先测试蒸馏水背景，再分别测试配制的两份溶液。

4.关机
打开样品室，取出样品池；退出操作界面，关闭氙灯；关闭氮气，关闭主机电源；关闭计算机和打印机；清洗样品池。

五、数据处理
实验测定D\L丙氨酸得到数据，以CD（θ）为纵坐标，以波长为横坐标作图。

图1 D-丙氨酸的圆二色光谱图
图2 L-丙氨酸的圆二色光谱图
分析：丙氨酸D型和L型的圆二色光谱图有显著区别，L型的CD值大于零，而D 型的CD值小于零。

根据圆二色光谱图CD值的不同可以判断手性物质为左旋或右旋，区别异构体，也可以作为定性鉴定物质的依据。

另一方面，样品的吸光度则与浓度成正比相关，可作为定量分析。

六、思考与讨论
1.圆二色光谱在手性物质分析中的应用？
答：光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同，圆二色光谱图不同，右旋CD值大于零，左旋的CD值小于零，从而可以判断手性物质的旋光性。

不同的物质，特征吸收波长不同，通过对比圆二色光谱图可以进行定性分析。

蛋白质的具有圆二色性，不同的构象表现出不同的光谱性质，因此可以通过圆二色光谱法进行测定。

圆二色光谱是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。

2.如何让利用圆二色谱对蛋白质进行定量分析？
答：假设蛋白质在波长λ处的CD信号是蛋白质中各种二级结构组分的线性加
和，则有等式：。

假设溶液态蛋白质与晶体中的二级结构相同，则可利用已知二级结构的蛋白质或多肽的CD光谱作为参考数据，对未知蛋白质的二级结构进行拟合计算，能得出а-螺旋、β-折叠、β-转角、无规线团等结构所占的比例。