1. 生物技术制药:采用现代生物技术人为地创造一些条件, 借助某些微生物、植物或动物来生产所需 的医药品。
2. 抗体:能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
3.疫苗:是指将病原微生物(细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支 原体、衣原体等)及其代谢产物,经过人工减毒、灭火或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。
4.反义核酸:包括反义DNA分子,或由部分RNA和部分DNA形成的RNA-DNA 嵌合分子,以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物。
5.载体分为:质粒载体和λ噬菌体载体。
①质粒载体涉及三个要素:复制子、选择标记、多克隆位点、几种质粒载体(克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体)②λ噬菌体载体:常用于构建基因组文库和cDNA 文库。
λ噬菌体载体通常分为插入型载体和置换型载体,插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA的插入,置换型载体是指外源DNA通过置换载体上非必需序列插入载体。
6.目的基因常用的制备方法:化学合成法、PCR法、基因文库法、cDNA 文库法。
7.基因工程药物制造程序:获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。
8.基因工程菌的培养过程:(1)摇瓶操作:了解工程菌生长的基础条件(温度、pH、培养基组分及C/N),分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响。
(2)培养罐操作:确定培养参数、控制方案及顺序。
基因工程菌的培养方式:(1)补料分批培养:将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后,间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的培养方式。
(2)连续培养: 将种子接入发酵反应器中,搅拌培养至一定浓度后,开动进料和出料的蠕动泵,以控制一定稀释率进行不间断的培养。
两阶段连续培养,控制和优化诱导水平、 稀释率、细胞比生长速率。
(3)透析培养:利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离,通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。
(4)固定化培养:维持质粒稳定性(5)分批培养:DO-Stat 法: 调节搅拌转速和通气速率控制溶氧在 20%,补料的流加速率是关键。
Balanced DO-Stat 法: 控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率,使乙酸维持在低浓度。
控制菌体比生长速率的方法:在最优表达水平获得高密度、高表达。
9.基因工程菌发酵工艺的影响因素:(1)培养基的影响(2)接种量的影响(3)温度的影响(4)溶解氧的影响(5)诱导时机的影响(温度、氧、营养)(6)pH的影响(细胞生长期、外蛋白表达期)(7)诱导表达程序的影响:热诱导10.动物细胞类型:①贴壁依赖性细胞(贴壁细胞):生长须有贴附的支持物表面,自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表 面上生长。
②非贴壁依赖性细胞(悬浮细胞):生长不依赖支持物表面,培养液中呈悬浮状态生长。
如淋巴细胞。
③兼性贴壁细胞:生长不严格依赖支持物。
如中国地鼠卵巢细胞,小鼠L929细胞。
11.动物细胞培养方法:①悬浮培养法:适合非贴壁依赖细胞、兼性贴壁细胞;操作简便、培养条件均一、传质和传氧较好、易扩大培养规模;细胞体积小、难采用灌流培养、细胞密度低;通气搅拌罐式与气升式生物反应器。
②微载体培养法:扩大贴附面积、保持悬浮状态;葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类。
③多孔载体培养法:增大比表面积;加钛等金属,增加比重,适合流化床反应器;不含钛等,比重轻,适合搅拌/气升式反应器。
④包埋和微囊培养法:人工合成高分子聚合物、糖类、蛋白质;琼脂糖、海藻酸钙凝胶最常用;温度、离子移变改变物相;保护细胞,避免损害;可获得较高密度;控制微囊粒径可浓缩产品,利于纯化;可用多 种反应器大规模培养。
⑤中空纤维培养法:模拟细胞在体内生长的三维状态,把细胞接种在中空纤维的外腔,利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养可以使细胞高密度的生长。
12.ACDD的作用机理:lgG与靶细胞表面相应抗原决定基特异性结合→NK 细胞借助其FcyRIII与结合于靶细胞上的lgGFc段结合→活化的NK细胞释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质杀伤靶细胞→靶细胞凋亡13.单克隆抗体制备流程图:用抗原免疫小鼠→免疫脾细胞 在聚乙二醇作用下 选择培养(HAT培养基)骨髓瘤细胞的培养→骨髓瘤细胞 融合成杂交瘤细胞 未融合的细胞死亡,杂交瘤细胞存活→阳性克隆的筛选及克隆化→克隆扩增及大量制备McAb14.制备单克隆抗体常见问题分析:①免疫失败的可能原因及措施:免疫动物的种属及品系是否合适,改变种属和品系;抗原质量是否良好,可改用之;制备抗原是否符合要求,可改变偶联剂、载体等;所用的佐剂是否合适,乳化是否完全等;免疫的方法、剂量是否合适;动物的饲养是否得当②细胞融合的影响因素、失败原因分析:污染;融合后杂交瘤不生长;杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体;杂交瘤细胞难以克隆化。
15.酶工程的研究内容:①酶的分离、提纯、大批量生产、应用开发②酶和细胞的固定化及酶反应器的研究③酶分子改造、化学修饰、酶结构与功能关系的研究④有机相中酶反应的研究⑤酶抑制剂、激活剂的开发与应用研究⑥模拟酶、合成酶及酶分子的设计与合成研究⑦抗体酶、核酸酶的研究⑧酶的定向进化技术。
16.酶、细胞的固定化方法:传统酶的固定化方法和新型酶的固定化方法。
传统酶的固定化方法:①载体结合法:是将酶结合与不溶性载体上的一种固定化方法,根据形式不同分为物理吸附法、离子结合法、共价结合法。
②交联法:是利用双功能或多功能交联试剂,在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化方法。
交联法制备较难,酶活损失较大,一般作为其他固定化方法的辅助手段。
③包埋法:将酶/细胞包埋在高分子凝胶细微网格中(网格型);将酶/细胞包埋在高分子半透膜中(微囊型)。
优点:细胞容量大、操作简便、酶的活力回收率高。
缺点:扩散阻力大、易改变酶的动力学行为、不适合催化大分子底物与产物的转化反应。
传统的酶固定化方法的缺点是酶在任意位点与载体进行连接,使酶活性位点不能充分暴露,而且酶的载量不高。
新型的酶固定化方法:是力求在较为温和的条件下进行,尽可能减少或避免酶活力的损失,并提高固定化效率。
目前有偶和固定化、无载体固定化(优点:细胞密度高、条件温和;缺点:机械强度差)。
利用酶和抗体之间的亲和力固定化等。
17.鸡卵黏蛋白:工艺流程:粗提鸡卵黏蛋白→鸡卵黏蛋白纯化→检定纯度粗提鸡卵黏蛋白:1. 操作过程:将鸡蛋清溶于等体积的10%的三氯乙酸中,加热至80℃保温,离心,取上清液。
原理:鸡卵黏蛋白在80℃下理化性质稳定,而有些蛋白在该温度下会变性。
目的:除去在80℃下不稳定的杂质蛋白。
2.操作过程:取上述上清液加无机盐盐析,调PH至等电点(3.9-4.5),搅拌后静置,离心,弃上清液,溶解沉淀物,透析,除残留的三氯乙酸。
原理:盐析、等电点可降低鸡卵黏蛋白溶解度,易析出;透析可除去无机盐。
目的:提纯蛋白质;除去在该PH下的可溶性杂质。
3.操作过程:将上述固体溶于等体积的10%的三氯乙酸中,调PH至3.5,有白色沉淀生成,静置,离心,取上清液。
原理:鸡卵黏蛋白在10%PH3.5的三氯乙酸中溶解度高。
目的:除去不溶性杂质(只要为鸡卵清蛋白质)鸡卵黏蛋白纯化:凝胶层析柱流程:装柱→平衡→上样→洗脱操作:将上诉沉淀物加入磷酸盐缓冲液,离心,取上清液,用凝胶层析柱过滤,控制流速,收集蛋白峰,得鸡卵黏蛋白粗提液。
原理:鸡卵黏蛋白溶于磷酸盐缓冲液;大分子蛋白质沿颗粒间的空隙以较快速度流过凝胶柱,最先流出柱外,而盐或小分子物质因进入凝胶颗粒的微孔中,流动速度较慢,所以最后流出柱外。
目的:通过凝胶层析可以除去小分子物质。
检定纯度:用紫外分光光度计测鸡卵黏蛋白吸光度。
原理:可用于检测鸡卵黏蛋白含量。
目的:检测纯度,纯度不大于90%的就要再进一步纯化。
18.菌种选育方法:包括自然选育、诱变育种、杂交育种等经验育种方法,还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因重组等定向研究方法。
(1)从自然界中获得新菌种:直接从自然界中分离的菌株称为野生型菌株,这种菌株往往很低,只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。
(2)自然突变与定向培育:自然选育可以达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产水平、提高产物产量的目的。
定向培育常用于氨基酸、核苷酸、维生素等药物产生菌的培养。
(3)诱变育种:具有方法简单、快速和收效显著等优点,是目前主要的育种方法之一。
(4)杂交育种:是一个重要的微生物育种手段,比起诱变育种,它具有更强的方向性和目的性。
(5)原生质体融合:是通过人工手段,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合,并产生重组子的过程。
(6)基因工程育种:目前基因工程产品主要是一些较短的多肽和小分子蛋白质。
19.菌种保藏的方法:(1)斜面低温保藏法:此法广泛适用于各类微生物菌种的短期保藏,主要保藏措施是低温。
(2)石蜡油封存法:此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏,不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。
(3)沙土管保藏法:适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。
(4)麸皮保藏法:适用于产孢子的霉菌和某些放线菌。
(5)甘油悬液保藏法:本法较简便,但需制备低温冰箱,基因工程菌常采用本法保藏。
(6)冷冻真空干燥保藏法:适用于各类微生物,其主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂。
(7)液氮超低温保藏法:适用于各类微生物菌种的保藏,其主要保藏措施是超低温、有保护剂。
(8)宿主保藏法:适用于专性活细胞寄生微生物。
20.红霉素提取工艺流程过滤调ph=9.8-10.2 调ph=4.0-4.2发酵液原滤液丁酯萃取液缓冲液萃取相醋酸乙酯缓冲液调ph=9.8-10.2 丙酮重结晶丁酯二次萃取液红霉素结晶红霉素纯品21.微生物转化:是微生物通过酶催化将一种物质(底物)转化成另一种物质(产物)的化学反应。
微生物转化反应的特点: ①跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特点 (蛋白酶为催化剂、对立体结构合成上具有高度的专一选择性、反应速度高、反应条件温和)②优点:可在常温常压、接近中性pH的水溶液中进行,减少器材损耗与环境污染。
对反应物与产物之立体异构物具有专一性。
缺点:易受有机溶剂或极端酸碱度的破坏。
酶活性易受产物抑制。
22.微生物转化甾体的特点:1.两阶段发酵:生产中要获得较多的转化酶,首先需要保证菌体的充分生长。
在利用微生物的酶对甾体底物的进行特定的化学反应来获取产物过程中,可以将微生物生长和甾体的转化这两个阶段分开。
一般在微生物生长阶段首先进行菌的培养,在菌体的生长过程中累积甾体转化所需要的酶,然后在载体转化阶段再利用这些酶改造载体分子。
2.两相发酵:利用生长好的微生物进行转化,一般有两种方法,一是直接在生长好的菌液内投加甾体,称为分批培养转化法。