第一章绪论·生物技术（biotechnology）：是指将生物用于有价值产品的生产。

·生物技术制药（biotechnology pharmaceutics）:用现代生物技术制造药物。

是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗、诊断疾病的药物。

·生物药物（biological drug）：从生物体中制取的各种天然活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。

·生物技术药物（biotechnological drug）:利用现代生物技术生产的蛋白质或核酸类等生物药物。

·现代生物技术的主要内容基因工程技术细胞工程技术酶工程技术发酵工程技术·生物技术制药的主要内容基因工程制药细胞工程制药酶工程制药发酵工程制药·基因工程技术：是将一种生物体的基因与载体在体外进行连接，然后转入另一种生物体内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。

·细胞工程技术：包括细胞及转基因细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞器（如线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作技术。

·酶工程技术：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。

·发酵工程技术：培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。

（抗生素、氨基酸、维生素）·生物制药：从生物材料中提取、分离、纯化药物的过程。

第二章基因工程制药·基因工程制药：是指利用基因工程技术生产蛋白质或多肽类药物。

·基因工程药物制造步骤:上游阶段：分离目的基因，构建工程菌，目的基因的表达。

下游阶段：从工程菌的大量培养到产品的分离纯化和质量控制。

·分离纯化的步骤：细胞分离-细胞破碎-固液分离-浓缩与初步分离-高度纯化直至得到纯品-成品加工·基因重组蛋白的主要分离技术：分离、沉淀（等电点沉淀法、盐析法）、膜分离、双水相萃取。

·基因重组蛋白的主要纯化技术:1.离子交换层析2.亲和层析3.凝胶过滤层析(分子量大的先洗脱下来）4.反相色谱和疏水色谱·亲和层析的主要步骤：a.配体固定化b.亲和吸附阶段c.洗涤阶段d.洗脱解离阶段e.再生阶段·凝胶过滤法的用途：脱盐、分级分离、分子量的测定·反相色谱和疏水色谱：根据蛋白质疏水性的差异来实现分离纯化的。

·基因工程药物的改造的目的：提高疗效降低毒副作用。

·基因定点突变技术（site-directed mutagenesis）:能够在基因水平上对所编码的蛋白质分子进行改造。

·融合蛋白：在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接, 由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白(fusion protein,FP)。

·融合蛋白的作用：延长半衰期、降低清除率·选择分离纯化方法的依据1.据产物表达形式来选择2.根据分离纯化单元之间的衔接选择3.根据分离纯化工艺的要求来选择·疏水层析和反相层析的区别:色谱种类反相色谱疏水色谱介质表面疏水性强弱流动相有机相水相分离产物易变性天然产物·基因工程药物的修饰与改造：1、构建突变体2、融合蛋白·基因工程药物的质量控制项目：1、蛋白质的含量测定2、蛋白质的纯度检测3、蛋白质Mr测定4、蛋白质等电点测定5、蛋白质序列分析6、内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析·蛋白质纯度的鉴定：电泳法、色谱法、质谱法、末端氨基酸残基分析法·蛋白质分子量测定:SDS－PAGE、凝胶色谱法、质谱法·内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析a.内毒素分析：鲎试剂、家兔体温。

b.宿主蛋白：免疫分析试剂盒。

c.核酸残留：核酸杂交法、PCR方法和高亲和力DNA结合蛋白。

第三章动物细胞工程制药·动物细胞生产药物的优缺点：优点:有翻译后修饰，与天然产品一致;分泌胞外、纯化方便。

缺点:培养条件高、成本高、产量低。

·体外培养动物细胞的类型：贴壁依赖性细胞、贴壁非依赖性细胞（悬浮细胞）、兼性贴壁细胞*显著污染的标志是：培养基的pH值迅速改变，细胞外形模糊。

·动物细胞培养的环境条件：（无细胞壁，对环境条件非常敏感）培养温度pH值通氧量防止污染基本营养物质渗透压·实验室动物细胞培养的基本技术：细胞的原代培养细胞的传代培养细胞克隆培养动物细胞的冻存与复苏·原代细胞（primary cell）：直接将动物组织或器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞称为原代细胞。

·原代培养方法：组织块培养法、单层细胞培养法。

·细胞传代(passage)：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作称为细胞传代。

·细胞克隆培养的方法：有限稀释法，软琼脂平板克隆法。

细胞的冻存：加保护剂如甘油、DMSO；缓慢降温。

·动物细胞冻存注意事项：①选对数生长期细胞；②冻存前一天要换液培养；③细胞密度1×106 ~ 2 ×106个／ml④冻存液加保护剂（DMSO、甘油）⑤冻存管封口后要检查其密封性；⑥标签标注细胞名称，编号和冻存日期。

·细胞复苏的注意事项：*细胞复苏的原则是快速融化①戴面罩和手套；②37℃水浴中迅速融化；③用乙醇擦拭冻存管的外壁；④尽早将细胞离心或稀释；⑤隔天看细胞，再换液一次。

·动物细胞的营养要求：水、碳源、氮源、维生素、激素及无机盐等。

·动物细胞培养基的分类：天然培养基；合成培养基；无血清培养基。

·动物细胞培养基的消毒：*不能采用高压法灭菌。

用膜过滤除菌、分装、储存。

·动物细胞培养常用的其他溶液： 1．平衡盐溶液：由生理盐水和葡萄糖组成。

2．培养基pH调整液：NaHCO3溶液、HEPES 3．细胞消化液：（1）胰蛋白酶溶液（2）EDTA溶液（非酶性解离）4．抗生素溶液·细胞系（Cell Line）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。

这种细胞世系由多种细胞组成。

·细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。

·生产用动物细胞的种类：1．原代细胞系2．传代细胞株3．转化细胞株4．工程细胞株·转化细胞株：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖的能力，得到的细胞株。

*CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）：已成功应用于表达促红细胞生成素(EPO) 、重组乙肝疫苗等。

（Chinese hamster ovarycell ）*SP2：小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞·细胞库的建立：⒈原始细胞库（master cell bank , MCB)⒉生产用细胞库(manufacturer´sworking cell bank , MWCB）（working cell bank）·动物细胞的大规模培养:是指在人工条件下（设定温度、pH、溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。

·动物细胞的大规模培养方法: 悬浮培养法微载体培养法多孔载体培养法微囊化培养法中空纤维培养法·常用的动物细胞生物反应器搅拌式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器透析袋式或膜式生物反应器固定床或流化床式生物反应器一次性摇袋式细胞培养生物反应器·动物细胞生物反应器的主要操作模式 :１．分批操作２．补料-分批操作３．半连续操作４．连续式操作５. 灌流式操作*工厂采用的操作模式主要是？工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批操作或补料分批操作这两种方式。

·转基因动物制作方法：采用基因工程技术把外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，再经过发育途径把外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即为transgenic animal。

·常用的转基因动物生物反应器：乳腺、血液、尿液、鸡蛋·体细胞核移植技术：a.目的外源基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞中；b.筛选导入外源基因的体细胞；c.此体细胞的核移植到去核卵母细胞中。

·体细胞核移植的优点:(1) 事先筛选转基因阳性细胞作为核供体, 极大提高阳性转基因动物生产率;(2) 培养的体细胞更易于进行基因打靶等基因操作;(3) 可以事先确定核移植后代的性别, 定向生产转基因动物。

第四章抗体工程制药·抗体工程制药：利用基因工程、细胞工程、发酵工程和转基因动、植物技术生产抗体药物的过程。

·人工制备抗体经历了三个阶段第一代：多克隆抗血清第二代：单克隆抗体(细胞工程抗体）第三代：基因工程抗体·抗原表位：epitope又称抗原决定簇（antigenic determinant，AD）指抗原分子中决定抗原性的特殊化学基团。

·抗体的结构·抗体的功能：a. binding （V区的功能）b.Induce immune responses after binding （ C区的功能）·V区的功能:特异性结合抗原（Recognize and bind antigen）：1.中和作用（病毒、毒素）2.阻止黏附3.凝集细菌·C区的功能:Induce immune responses after binding:1.激活补体（complement dependent cytotoxicity，CDC）2.结合Fc受体:a.调理作用b.介导antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，ADCCc.介导I型超敏反应3.穿越胎盘和黏膜·单克隆抗体制备流程图：·抗原的制备：重组蛋白抗原提取纯化的天然抗原合成多肽半抗原小分子半抗原半抗原与载体偶联·免疫方法：体内、体外、脾内免疫法·细胞准备：1.饲养细胞（feeder cells）2.骨髓瘤细胞*选对数生长期，活细胞计数＞95％3.免疫脾细胞·杂交瘤细胞的克隆化方法：有限稀释法、软琼脂法·单链抗体：是利用DNA重组技术将抗体一条VH和一条VL基因通过一短肽链（接头DNA, linker）连接后表达出来的抗体片断。