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主要内容

菌种的来源


生物物质产生菌的筛选
微生物选择性分离的原理和发展 重要工业微生物的分离

菌种选育

自然选育 诱变育种
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
抗噬菌体菌株的选育
杂交育种 原生质体融合技术 DNA重组技术 菌种保藏
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2.1 菌种的来源

生物物质产生菌的筛选 微生物选择性分离的原理和发展

菌的营养特征：廉价、来源广。

菌的生长温度：高于40 ℃，

降低冷却成本； 提高反应速度；

有时利于产物分离，如乙醇发酵，高温产物的蒸馏变得容易。

菌对设备和生产过程的适应性。 菌的稳定性。 菌的产物得率和产物在培养液中的浓度 容易从培养液中回收产物。
产物的毒性。
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（1） 施加选择压力的分离方法


定向的分离培养基配方的选择

取决于对微生物营养生理的了解程度和经验，以选择更合理的培养 基配方。

分子生物学技术的应用

DNA杂交技术 基因芯片的发展
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空气调节器
泵
Water Level
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储液瓶
磁力搅拌器
发酵液
恒化器示意图
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2.1.3 重要工业微生物的分离

分离/isolation 是指获得纯的或混合的培养物。 筛选工业微生物
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极端嗜压菌 (Barophiles)

一般生活在深海底 ，能耐普通微生物不能忍耐的高压。低于 0.4-0.5ＭPa则不能生长。

美国发现的一些种能够生长在 1.3-1.4ＭPa环境中。日本在 3000-6000ｍ深的深海鱼类肠道内发现了极端嗜压菌。多为古 细菌。

应用

日本发现的深海鱼类肠道内的嗜压古细菌 ，80 %以上的菌株可以生产 EPA和DHA，最高产量可达 36%和 2 4%。
特殊环境微生物的开发利用

极端环境微生物的代谢产物
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极端嗜热菌 (Thermophiles)

最适生长温度在 90℃以上的微生物 ，被称做 极端嗜热菌。 2 0多个属 ，大多是古细菌 ，生活在深海火山 喷口附近或其周围区域。 嗜热菌的营养范围很广 ，多为异养菌 ，其中 许多能将硫氧化以取得能量
在pH9～10的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白质)表面。

碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白，产生一清 晰圈。清晰圈的大小可以初步作为选择高产菌的依据。
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平板分离培养
大肠杆菌平板菌落
细菌菌落
霉菌菌落
裴氏着色芽菌的菌落
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硅酸盐细菌菌落
海洋微生物菌落
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（2） 随机分离方法

大多数情况下，采用随机分离方法分离菌株。
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材料的预处理
(1) 含微生物材料的选择

材料来源的广泛性 特定环境压力下的材料更容易筛选到特定的微生物类群

耐高温、嗜高温——温泉、火山口、海底热液喷口

耐低温/嗜低温——海底、雪山
嗜酸：矿山酸性废水


脂肪酶产生菌：屠宰场土壤
（光合细菌：池塘、污水处理厂）

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特殊环境
台北阳明 山小油坑
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极端嗜碱菌 (Alkaliphiles)


盐碱湖或碱湖、碱池中 ，生活环境 pH值可达 11.5以上 ， 最适 pH值 8-10。 应用

如用耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶作洗涤剂的添加成分； 碱性淀粉酶用于纺织品退浆； 用于皮革工业中的脱毛工艺以提高脱毛效率和质量； 利用嗜碱菌进行苎麻脱胶。

材料的预处理
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(3) 所需菌种的分离

适当的培养基： 广泛使用的三种培养基为：

几丁质培养基—土壤和水中的放线菌
淀粉-酪素培养基——分离的放线菌种类与几丁质培养基
相似，但菌落密度更大、色素更多，细菌容易生长。 M3培养基——容易分离链霉菌以外的其他放线菌如红球 菌。

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所需菌种的分离（续）
嗜冷菌：4-10 ℃

培养的时间

一般的嗜温菌链霉菌、小单胞菌7-14d 嗜热菌1-2d 长时间培养可能得到不寻常的菌种
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菌落的选择

菌落的选择非常重要，决定筛菌的成功以及使筛菌的效率。 具体方法取决于筛菌的目的。

常用方法：

铺菌法：一个分离平板试验一种菌测定各个菌落的抗生
素产生能力。缺点：菌落被污染。
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嗜中温浸矿微生物富集

温泉水样 液体培养基配方：9k基本盐【（NH4)2SO4 3g/L ； KCl 0.1g/L ； K2HPO4 0.5g/L ； MgSO4.7H2O 0.5g/L ；
Ca(NO3)2 0.01g/L】

能源：液体培养以S粉做能源物质，设计S粉浓度分别为5 g/L，Yeast extract浓度0.5 g/L

嗜压菌可以用于高压生物反应器。
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极端嗜冷菌 (Psychophiles)

深海的极端嗜压菌往往也是极端嗜冷菌。在真核 生物中也有一些嗜冷的真菌和藻类 ，它们在两极冰 雪和高山雪坡上生长。极端嗜冷菌的最适生长温度 一般为 - 2℃以上 ，高于 1 0℃则不能生长。

应用

国内的应用报道较少。 国外有人将嗜冷酶应用于洗涤剂中。
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(2) 材料的预处理

热处理：减少细菌数量，因为许多放细菌的孢子和菌丝片断比G(-)细菌
细胞耐热。同样也减少放细菌的数目；

水样品的浓缩：滤膜过滤、离心； 添加固体基质或喷淋可溶性养分，增加特定微生物的数量； 或诱使特定微生物附着在固体基质上。


黄瓜+菜园土——腐酶 花粉+土壤——小瓶菌 腐霉菌（Pythium spp.17 ）

随机分离培养基制作原则：

制备一系列培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素（C、 N、P、O）； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源（葡萄糖）或氮源（NH4+），它们可能引 起分解代谢物阻遏（与容易同化的碳源接触，而使酶合成速率相对 降低的作用）； 确定含有所需的辅因子（Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+），以利于酶的 活性； 加入缓冲液减少pH变化。
Thermus aquaticus



应用

利用菌体发酵 :有人用极端嗜热菌生产乙醇。
Mud Volcano Area

利用菌体产生的酶 :如用于PCR技术的TaqDNA
聚合酶 ，是从嗜热古细菌Thermus aquaticus中 分离出来的。

为基因工程菌提供特异性基因
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极端嗜酸菌 (Acidophiles)
复印平板法
印章复印菌落
原始菌落
试验菌平板
产生抑菌圈
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未来的发展

天然基质的选择：特定的天然环境必定有特定的微生物。重视微环
境的变化，如厌氧微生物。

富集技术的发展

（1）分离前改变天然菌群的组成，利用微生物生理知识，如前体的 加入可以富集合成相应次级代谢物的菌类。 （2）恒化器（Chemostat) 培养混合菌，富集目的菌。

A：诺尔斯氏链霉菌；
B：皮疽诺卡氏菌；
C：酒红指孢囊菌； D：游动放线菌；
E：小单胞菌；
F：皱双孢马杜拉放线菌
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产抗菌素的放线菌的菌落特征

A：卡特利链霉菌； B：弗氏链霉菌； C：吸水链霉菌金泪亚种； D：卡那霉素链霉菌； E：除虫链霉菌； F：生磺酸链霉菌





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选择性
灵敏度
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2.1.2 微生物选择性分离的原理和发展
介绍放线菌纲为主的分离方法原理的发展。

选择性分离方法大致可分为五个步骤：

含微生物材料的选择
选择压力，或进化压力，可 以被认为是外界施与一个生 所需菌种的分离 物进化过程的压力，从而改 变该过程的前进方向。所谓 菌株的培养 达尔文的自然选择，或者物 竞天择，适者生存，即是说， 菌落的选择和纯化 自然界施与生物体选择压力 以上任何一个阶段都可引入选择压力： 从而使得适应自然环境者得 以存活和繁衍。
欲筛选耐高温微生物，在高温（>50 ℃)条件下连续培养；
欲培养降解PCP（五氯酚）的微生物，在基质中加入
PCP。
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B 固体培养基的使用

常用于分离某些酶产生菌，其选择性培养基常含有所 需酶的基质，以促进酶产生菌的生长。如蛋白酶、脂 肪酶。

例：分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌属

土壤须经巴氏法消毒，以减少不产孢子的微生物。然后铺

适当的pH条件

大多数放线菌为中性，培养基pH为6.7-7.5。 分离嗜酸性放线菌，pH4.5-5.0。

加入抗生素

抗真菌抗生素，对放线菌无影响；

抗细菌抗生素同时影响放线菌数量，选择合适的抗细菌
抗生素如新生霉素、亚胺环己酮能分离出普通高温放线
菌。
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菌种的培养

培养的温度

常温：25-30 ℃ 嗜热菌：45-55 ℃

培养基pH值设臵：分别用2.0、3.0、4.0进行实验 培养条件：50度，200rpm。
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连续培养筛选菌株