➢ 胸苷激酶基因（tk）选择系统 ➢ 二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统 ➢ 黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（HGPRT）选择系统 ➢ 新霉素抗性基因（neo）选择系统 ➢ 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统 ➢ 潮霉素抗性选择系统
细胞内DNA的合成途径
细胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式
真核细胞稳定转染筛选标记 及原理
小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）
滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星
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外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞 株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表 达稳定。需要长时间的抗性选择培养。
酵母表达系统常用的选择性标记
❖ 营养缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-，
lys2-。 ❖ 显性选择标记，用于野生型酵母菌
的转染。G418筛选。
哺乳动物细胞遗传性标记
▪ H：次黄嘌呤；补救合成核苷酸的原料 ▪ A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 ▪ T：胸苷；补救合成dTTP的原料 ❖ 作用机理：TK是核苷酸补救合成途径的一个关键 酶
二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系 统
❖ 遗传标记：DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关 键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸
❖ 编码产物：二氢叶酸还原酶（DHFR） ❖ 筛选药物：叶酸类似物——氨基喋呤或氨甲喋呤 ❖ 作用机理：dhfr—缺陷型细胞因不能合成核酸而
1.主要途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸脲甘酸在二 氢叶酸还原酶的催化下合成DNA
2.旁路途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶 （TK）的催化下补救合成DNA。
胸苷激酶基因选择系统
❖ 遗传标记：TK ❖ 编码产物：胸苷激酶 ❖ 筛选药物：HAT选择法
常用的真核表达系统
❖酵母表达系统 ❖丝状真菌表达系统 ❖昆虫表达系统 ❖哺乳动物表达系统
转 染 方 法
理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、 细胞毒性小等特点。病毒介导的转染技术，是 目前转染效率最高、细胞毒性很低，但准备程 序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。 非病毒介导的转染技术中，以阳离子非脂性物 质为主的混合物配方转染效率最高。该类转染 具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且 不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质 体介导的转染方法更方便。
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
❖ 遗传标记：HPH ❖ 编码产物：潮霉素B磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：潮霉素B ❖ 作用机理：HPH灭活潮霉素B
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死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
影响80S核糖体功能核蛋白质的合成 ❖ 作用机理：新霉素抗性基因编码3磷酸转移酶降解
G418。适因选择系统
❖ 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
❖ 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ❖ 筛选药物：氯霉素 ❖ 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目
转染后的表达
1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，
进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大 部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后 几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上， 出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒 纯度、浓 度和转染效率。
2.稳定表达
转染的质粒DNA整合到染色体上可以持续存 在，转染的细胞可以长期表达。
将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，能表达 XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救 合成GMP，使DNA合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克隆 因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细胞则受霉酚酸的抑制 而死亡，以此来筛选阳性细胞。
新霉素抗性基因选择系统
❖ 遗传标记：APH ❖ 编码产物：氨基糖苷磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：新霉素，即G418一种氨基糖苷类抗生素，