荧光分析法测定维生素B2药片含量
一实验目的
1.掌握荧光分析法测定维生素B2含量的原理及方法。

2.熟悉荧光分光光度计的结构和使用方法。

二基本原理
维生素B2（即核黄素）的溶液在430~440nm蓝光照射下，会发黄绿色荧光，荧光峰值波长为535nm。

在pH6~7的溶液中荧光最强，在pH>11时荧光消失。

醋酸溶液中荧光强度将会增强。

其它条件一定时，维生素B2的稀溶液（0.5~5μg/ml）的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

本实验采用标准曲线法。

利用维生素B2可被还原剂（连二亚硫酸钠）还原为非荧光性物质，通过测定加还原剂前后样品液的荧光强度，来消除可能的样品基体干扰，基于上述原理来测定药片的维生素B2含量。

三仪器与试剂
（一）仪器
荧光分光光度计，样品池（石英），10ml刻度吸管，10ml具塞比色管
（二）试剂
维生素B2贮备液（100μg/ml）
避光操作，精确称取100mg维生素B2(生物试剂，避光干燥保存)置于250ml烧杯中加冰醋酸10ml及蒸馏水90ml在水浴上加热溶解后，放冷，转入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，移入棕色瓶中放暗处保存。

维生素B2标准应用液（1.0μg/ml）
实验当天用移液管准确吸取标准贮备液5.0ml于500ml棕色容量瓶中，用1%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀。

1%醋酸溶液
取1ml冰醋酸用去离子水稀释至100ml。

连二亚硫酸钠（AR，保险粉）
四操作步骤
1.样品药液制备
1）取核黄素药片10片，研细，称出适量（约相当于维生素B210mg）置于250ml烧瓶中加冰醋酸10ml，加蒸馏水90ml，置水浴上加热约1小时，并时时振摇使其溶解澄清后放冷，转入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，移入棕色瓶中避光保存。

该样品药液含维生素B2 10μg/ml。

2）用移液管准确吸取维生素B2药液10ml于100ml容量瓶中，用1%醋酸液稀释至刻度，摇匀，取此溶液10ml于比色管中，按与标准系列同样步骤测定此溶液的荧光强度。

2.标准系列的配制
取10ml比色管6支，按下表配制标准系列管：
0 1 2 3 4 5
维生素B2标准应
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
用液（1.0μg/ml）
3.仪器调试
1）接通仪器及电源开关，再打开电脑及工作站。

2）取标准系列浓度最高管（5号管），固定荧光波长535nm，在350~500nm的波长范围内，扫描不同激发波长下的荧光强度，得到以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标的激发光谱，确定激发光波长λex。

3）固定激发光波长λex，在450~600nm的波长范围内，扫描不同荧光波长下的荧光强度，得到以荧光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标的荧光光谱，确定荧光波长λem。

4.测定
1）在λex和λem固定的条件下，将摇匀后的标准系列管，按浓度由低到高依次倒入样品池中，分别测出荧光强度并记录填入下表中。

以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

管号0 1 2 3 4 5
维生素B2浓度
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
（μg/ml）
F n
F n-F0
2）相同条件下测定样品液荧光强度，记为F样。

再在测定过的样品液中加入保险粉约10~20mg，轻轻摇动后迅速倒入样品池中，测定荧光强度，记为F空白（30秒钟之内测完）。

以F样-F空白值在标准曲线上查出相应的维生素B2浓度。

3）测试完毕后，关闭电脑及工作站，再关闭仪器及电源开关。

五注意事项
1.连二亚硫酸钠能将荧光型维生素B2还原为非荧光型维生素B2，但不可多加，否则
将其它还原性物质还原使测定结果偏高。

同时，加入保险粉后应立即测定荧光强度，否则维生素B2又被氧化为荧光性，且多加或长时间后溶液会出现沉淀。

2.为防止维生素B2见光分解，实验应注意避光。

3.荧光测定中的样品池为四面皆光面的方形石英玻璃池，为防止污染，应手持不在光
路的边棱。

六思考题
1.为什么要选用标准系列浓度最高管调试仪器？
2.是否能用荧光计代替荧光分光光度计测定荧光光谱和激发光谱，为什么？。