一般物质 f
0~1之间
荧光效率的大小与荧光发生过的快慢有关； 荧光过程的快慢取决于分子的结构； 而其他的去激化过程不仅取决于结构，更多的取决于化学环境。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
能发射荧光的物质具备条件：
①有强的紫外-可见吸收
②有一定的荧光效率。
1.跃迁类型: 荧光物质n➙π*或π ➙π *跃迁。
第二节 基本原理
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
一、分子的激化
基态时，一 个给定轨道 中的两个电 子，具有相 反方向的自 旋。 当吸收 光辐射被激 发而跃迁至 激发态时：
单 重 基 态
不发生自 旋方向的 改变
激 发 单 重 态
激 发 三 重 态
发生自旋 方向的改 变
S0
S1
T1
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
荧光发射：电子通过内转换及振动弛豫，可返回到第一激发
单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返
回至基态的任一振动能级上时发射的光量子。 由于振动弛豫和内转换损失了部分能量，故荧光的波长 总比激发光波长要长。 磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发 三重态的最低振动能级并存活一段时间，然后返回至基态的 各个振动能级而发出的光辐射。
摩尔吸光系数 激发效率
小 大（10-2-10-3倍）
跃迁类型
n➙π* π ➙π *
跃迁寿命
10-7-10-9s 10-5-10-7s
能级差
小 大
π ➙π *主要跃迁类型； 含π ➙π *共轭体系是荧光分析的主要研究对象。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
2. 共轭结构：共轭程度越大，荧光强度越大，而波长也长移。 苯 0.11 萘 0.29 蒽 0.36

温度 溶剂 pH值
温度升高，荧光效率和荧光强度降低。
溶剂极性增强，荧光强度增强，波长长移。 溶剂粘度降低，荧光强度降低。
弱酸或弱碱的时，有较大影响。

荧光熄灭
荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作
用引起荧光强度降低。卤素离子，重金属离子，氧 分子，硝基化合物，重氮化合物等。
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仪器分析
散射光
瑞利散射：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能 量转换，仅仅光子运动方向发生改变。与激发光波 长相同 拉曼散射：发生非弹性碰撞时，方向发生改变的同时发生能 量交换，发射光波长会改变。比激发光长，与荧光波长接近
荧光波长 荧光波长
拉曼散射
拉曼散射
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仪器分析
Hale Waihona Puke 2、荧光光谱的形状与激发波长无关
3、荧光光谱与激发光谱有镜像关系
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仪器分析
三、荧光与分子结构
荧光发生过程比其他激发过程快，才能观察到荧光发射现象。
荧光效率 (f) ：激发态分子发射荧光的光子数与 基态分子吸收激发光的光子数之比。
f=
发射荧光的光子数 吸收激发光的光子数
cs cx
cx
I f ,s I f ,0 I f , x I f ,0
cs
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仪器分析
散射光的干扰主要是拉曼散射对荧光波长的干扰，消除方法：
1.选择合适的激发光波长
2.选择合适的试剂 分子荧光法对有机化合物的分析应用：
1. 脂肪族化合物基本没有荧光吸收，加入荧光剂，才能测定
2. 芳香族化合物具有共轭不饱和体系，大部分由荧光
3. 胺类，甾族化合物，蛋白质，酶和辅酶等也可用荧光测定
第十一章
荧光分析法
仪器分析
习题： 1、外部能量转换将（ ）荧光强度。 ）。
2、荧光光谱中，发射波长总是比激发波长（
3、能够发射荧光的物质应具备的条件是（
）、（
）。
）。
4、荧光法与紫外吸收法相比，荧光法测定的优点是（ 5、什么是荧光发射？ 6、荧光光谱的特征？ 7、简述荧光和磷光的区别。
单色器：干涉滤光片或光栅 半宽度窄，透光率窄，耐用等特点。 样品池：石英吸收池 检测器：光电倍增管
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仪器分析
显示器 荧光波长纽
样品室
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仪器分析
第四节
荧光定量分析方法
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
第三节
仪器与其他荧光分析技术
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
一、荧光分光光度计
主要部件：激发光源、激发单色器、发射单色器、样品池、 检测系统等。
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仪器分析
激发光源：高压汞灯，氙灯，卤钨灯，激光 所发射的谱线强度大、而且是连续光谱，并在300～
400nm波长之间的谱线强度几乎相等。
与荧光比较辐射能量更小，波长更长。
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仪器分析
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
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仪器分析
去激化过程 振动弛豫 内转换 外转换 体系间跨越 荧光 磷光
是否发 射电磁 辐射 否 否 否 否 是 是
涉及的能级 同一激发态的振动能级间 不同激发态的振动能级间 第一激发态单重态或三重态 最低能级 从激发态单重态-----三重 态（电子自旋发生改变） 第一激发单重态最低振动能 级---基态 激发三重态最低振动能级--基态
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仪器分析
外部能量转换：溶液中激发态分子以热能的形式释放能量的 过程。常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能
级向基态转换的过程。
会降低荧光强度
体系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分 子的多重性发生变化的过程。常见于含重原子（碘，溴等） 有机化合物分子中。
仪器分析
激发态类型
磁性
寿命 10-8S 10-4-1S
跃迁 允许跃迁
能量 高
单重态（S） 抗磁性分子
三重态（T） 顺磁性分子
禁阻跃迁
低
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仪器分析
二、几种去激化过程 振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子
碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到 同一电子激发态的最低振动能级的过程。 特点：属于无辐射跃迁、只能在同一电子能级内进行 内部能量转换：当两个电子激发态之间的能量相差较小以 致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐 射方式转移至低电子能级的过程。
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仪器分析
光致发光：有些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外，还会
发射出比原来所吸收光的波长更长的光。
荧光：
磷光：
荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量 测定的方法。 优点：灵敏度高，选择性好。
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仪器分析
寿命 10-12—10-14s 10-11—10-13s 激发三重态 分子易发生
10-6—10-9s 10-4—10s
振动弛豫和 内转换 体系间跨越 和振动弛豫
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仪器分析
二、激发光谱与发射光谱
激发光谱：固定发射波长，以不同波长的入射光激发荧光物质。 以荧光强度对激发波长作图。λex,最大激发波长，定量分析用。 荧光光谱（发射光谱）：使激发光的波长和强度保持不变，以荧 光强度对发射波长作图。λem,最大荧光波长，定量分析用。 荧光光谱特征： 1、斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长
仪器分析
二、定量分析方法
1.标准曲线法 参照紫外法，选择浓度最大的标准溶液做基准，调节荧光强 度为100或某个最大值，测定其他溶液的相对荧光强度。 2.比例法（对比法）
I f , s I f , 0 Kc s I f , x I f , 0 Kc x
I f ,s I f ,0 I f , x I f ,0
低浓度（小于10-6g）时，荧光的强度与荧光分子浓度 呈正比关系------定量的依据
If=2.303φfI0ECl=KC

ECl≤0.05 If C ECl >0.05 If 与C不成正比
浓度高时，荧光减弱，称为自熄灭。
自熄灭使荧光强度与荧光分子浓度偏离线性关系，产生误差
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
3. 分子刚性：分子刚性（不能自由旋转）越强，π电子共轭程度 增大，荧光强度也越强，而波长也长移。 给电子取代基：p-π共轭，增强荧光效率，波长长移。 4. 取代基 吸电子取代基：减弱荧光，甚至熄灭。 卤素原子：增加激发分析的体系间跨越，荧光减弱。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
三、影响荧光强度的外部因素