CH2 OH
例：维生素B2的测定
称核黄素，是一种生长促进剂，
常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆 类、花生、蘑菇和海藻中， VB2易溶 于强酸或强碱性溶液。
HC
3
HO CH HO CH HO CH CH2 N N O N O NH
H3 C
在低浓度情况下，F= KC，F与C呈线性关系，
在pH6～7荧光最强。
S = ±1/2（自旋量子数） M = 2S+1（电子能态多重性）
分子的激发态
单重态： 当基态分子的电子都配对时，S = 0，多重性
M = 1，这样的电子能态称为单重态。
单重电子激发态： 当基态分子的成对电子吸收光能之后，被激
发到某一激发态上。如果它的自旋方向不
变，S = 0，M = 1，这时的激发态叫单重电
去活过程及荧光的产生
物质分子处于基态最低振动能级
紫外光照射，吸收两个 能级之差的能量
跃迁至单重电子激发态的多个能级
由于分子之间的振动与撞击， 能 量降至第一激发态最低振动能级。
去活过程及荧光的产生
激发态较高能级
激发态较高能级 激发态最低能级
பைடு நூலகம்
能量以热的 形式释放
（无辐射迁）
能量以光量 子形式释放
基态各能级
荧光光度计主要部件
检测器： 光电管或光电倍增管。 样品池 石英样品池
荧光分光光度法用途： 定性分析：因物质结构不同，吸收紫 外光波长也不同。


定量测定：同一种物质的稀溶液，
浓度大的发射的荧光较强。
无机化合物的分析
• 无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定 的为数不多，但与有机化合物反应生成具荧光
能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致
癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的 测定方法。
例：3，4 – 苯并芘的测定
3，4 – 苯并芘为强致癌物质

煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸 烟、焚烧垃圾都会产生3，4 – 苯并芘，汽车 尾气也是主要来源。 食品加工过程也会产生3，4 – 苯并芘，尤其 是烟熏、油炸、烘烤食品。 分析测定：用环己烷将3，4 – 苯并芘从试样 中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化， 然后用色谱法分离纯化，用95%乙醇稀释，用 荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量。
当φf、I0、ε、b 固定不变时，F 与 C 成正比。
∴ F = K ∙c （εb c≤0.05 ）（2）
定量分析方法 标准曲线法： F = K ∙ c 以荧光强度为纵坐标，标准溶液 浓度为横坐标绘制标准曲线。
定量分析方法
标准对照法 ：
若标准曲线通过零点，就可以选择其线性
范围，用标准对照法进行测定。
产生荧光
去活过程
处于激发态各不同振动能级的电子
无辐射跃迁
去活过程 产生荧光 基态
磷光的产生
激发态分子
无辐射跃迁
单重电子激发态最低振动能级
无辐射跃迁（体系跨越）
第一电子三重激发态
光辐射，产生磷光
降至基态各能级
磷光和荧光的区别
荧光
产生 S1* 最低振动能
磷光
三重态 较长 10-4 ～几秒 少见 基态
的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多
种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、
Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。
有机化合物的分析
• 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身 能发射荧光的很少，一般需要与某些试剂反应
后才能进行荧光分析。
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数
荧光的定量分析 Ia = I0（1 - e - 2.303εbc ）
e - 2.303εbc = 1 - 2.303εbc，（εb c≤0.05）
Ia = I0 · 2.303εbc F =φf ∙ Ia
荧光的定量分析

荧光强度与溶液浓度的关系:
∴ F =φf ∙Ia = 2.303∙φf∙ I0∙εb c
荧光法与UV-Vis法的比较： 相同点：
都需要吸收紫外-可见光，产生电
子能级跃迁。
荧光法与UV-Vis法的比较：
不同点：
UV-Vis法测定的是物质溶液对紫外-可 见光的吸收程度 (A) 。

荧光法测定的是物质经紫外-可见光照 射后发射出的荧光的强度(F)。
荧光和磷光光谱法
激发态 第一激发态最低振动能级 基 态
概 述：
分子结构：分子中含有共轭双键体系，具
有吸收辐射能，产生电子跃迁
的能力。
环境条件：适当的辐射能照射，温度、溶 剂、酸碱度等。
概
述：
荧光光谱的范围较广，可以从X光到红
外光谱区。 某些物质受紫外光照射后能发射比吸 收的紫外光波长更长的紫外光荧光或 可见荧光。
基本概念：
光致发光：当物质吸收电磁辐射并被激
质分子的相互作用引起荧光强
度降低的现象。
荧光熄灭剂：
荧光的定量分析
I0 F
Ia
I
F = Φ f Ia （1）
荧光的定量分析 F =φf ∙ Ia ，Ia = I0 - I
I / I0 = 10-εbc
I = I0· -εbc 10
Ia = I0 - I0· -εbc = I0（1- 10-εbc ） 10
第九章 分子荧光光度法
Molecular Fluorescence Spectrophotometry
内

容
分子荧光光度法概述


去活过程及荧光和磷光的产生
物质分子结构与荧光的关系
环境对荧光的影响
荧光定量分析方法 荧光分光光度计
概
述：
一种物质能否发射荧光，取决于它 的分子结构和它所处的环境条件。
发后产生的一种发光形式。
分子荧光光度法：利用物质分子发出荧 光的强度（F）进行分析的方法。
用 途
定性分析：
由于不同物质结构不同，吸收的激发光波 长也不同，利用这一性质可以鉴别物质。 定量测定：
同一物质的稀溶液，浓度大的荧光较强，反
之则较弱，利用这一性质可进行定量测定。
荧光光度法的特点：
优点：灵敏度高，可达 ng/ml ；选择性强， 重现性好；取样少；可提供较多物理 参数。 缺点：许多物质本身不能发射荧光，因此， 应用不够广泛。
Fs –F0 = 2.303 ∙φf ∙ I0 ∙εbcs （1）
Fx –F0= 2.303 ∙φf ∙ I0 ∙εb cx （2）
cx = cs ∙（ Fx – F0 ）/ （Fs – F0）
影响荧光测定的因素
激发光源
散射光：当一束平行光投射在液体样品上，
部分光线透过溶液，小部分由于光
子和物质分子碰撞，使光子运动方向
发生改变而向不同角度散射，这种光
称散射光。
散射光的影响
瑞利散射光（Rayleigh Scattering light）：
光子和物质分子碰撞时，未发生能量的 交换，仅光子运动方向发生改变。 拉曼散射光（Raman Scattering light）： 在光子运动方向发生改变的同时，物质
分子的能量会发生改变。

物质分子必须具有能够吸收紫外或可见光的
结构，并且能产生π π* 或 n π* 跃迁。

荧光物质必须有较高的荧光量子产率。
发射荧光量子数
吸收激发光量子数
荧光量子产率 =
有机化合物分子结构与荧光的关系： 共轭结构： 凡是能提高π电子共轭度的结构， 都会增大荧光强度，并使荧光光 谱长移。
苯
萘
蒽
有机化合物分子结构与荧光的关系：
在430
～ 440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，
em = 535nm下测 F ，用标准曲线法测定。
内容小结：


环境对荧光的影响
溶液荧光强度和该溶液的吸光程度以及
溶液中荧光物质的荧光量子产率有关。
F = Φf Ia

F = K ∙c
荧光定量分析法
照法。
标准曲线法和标准对
内容小结： 影响荧光测定的因素主要是激发光源
子激发态。
分子的激发态
图示：
单重电子 激发态
基态
分子的激发态
三重电子激发态： 若通过分子内部的一些能量转移，或能阶间 的跨越，成对电子中的一个电子自旋方向倒 转，使两个电子自旋方向相同而不配对，这
时S=1，M=3，这种电子激发态称三重电子激
发态（三重态）。
分子的激发态
激发态
三重电子激发态
S=1，M=3
刚性平面：分子的刚性及共平面性越大, 荧光量子产率就越大。
OH O OH
OH OH
C
O
C
O
C
O
C
O
荧 光 素
酚 酞
取代基：在芳香化合物的芳香环上，进 行不同基团的取代，对该化合
物的荧光强度和荧光光谱都会
产生影响。
环境对荧光的影响 温度
温度升高 分子间碰撞次数增加
分子内能转化加速 荧光强度降低

对荧光强度的影响和散射光的干扰。

荧光光度计的基本结构和工作原理。
级
波长 寿命 几率
基态
较短 10-8 S′ 较大
激发光谱和荧光光谱
激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，测
定不同波长照射下所发射的荧光强
度（F），以 F做纵坐标，激发光波
长λ做横坐标作图。
激发光谱反映了激发光波长与荧光强度之间
的关系。
激发光谱和荧光光谱
荧光光谱：固定激发光波长，让物质发射的荧
光通过单色器，测定不同波长的荧