呼吸道九联检操作程序呼吸道感染概述一、气管和支气管等咽喉呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、、上呼吸道感染常见的分为上呼吸道感染和下呼吸道感染呼吸系统，。

指鼻腔是急性上呼吸道感染、），tract infectionupper（acute respir 常见病因是呼吸道最常见的一种传染病咽或喉部急性炎症的概称。

，不仅性别职业和地区为病毒少数由细菌引起患者不分年龄。

、，、。

下呼吸道感染是最常见具有较强的传染性而且可引起严重并发症。

，肺炎支气管炎慢性支气管炎的感染性疾患包括急性气管——、，、、军团菌等微生物引衣原体由病毒支气管扩张等细菌支原体、、、，、治疗时必及时治疗的原则起其防治应遵循预防为主准确诊断，，、、须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。

免疫荧光法介绍一、又称荧光抗体免疫荧光技术）technique（Immunofluorescence生物化学是标记免疫技术中发展最早的一种它是在免疫学技术、。

，很早以来就有一些学者和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

利用抗原抗体反应进行组织或试图将抗体分子与一些示踪物质结合，年首次采用荧光素进行标等于细胞内抗原物质的定位1941。

Coons 这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为记而获得成功。

用荧光抗体示踪荧光抗体技术technique）。

fluorescent（antibody 用已或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；这两知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。

因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合种方法总称免疫荧光技术，，用于检测或定也可以与其他蛋白质结合用于检测或定位各种抗原，，位抗体但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用所以人们习惯称，，为荧光抗体技术或称为免疫荧光技术用免疫荧光技术显示和检查。

，细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞或组织）（化学技术。

荧光免疫法按反应体系及定量方法不同还可进一步分做若干种。

，与放射免疫法相比荧光免疫法无放射性污染并且大多操作简便，，，便于推广该技术的主要特点是特异性强敏感性高速度快主。

：、、。

要缺点是非特异性染色问题尚未完全解决结果判定的客观性不足，，：技术程序也还比较复杂但近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，。

已经很好改善了这些缺点与酶免疫测定和放射免疫分析一样应用，，在临床检验中。

原理．1免疫学的基本反应是抗原抗体反应由于抗原抗体反应具有高-。

度的特异性所以当抗原抗体发生反应时只要知道其中的一个因素，，，就可以查出另一个因素免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的。

荧光色素标记在抗体或抗原上与其相应的抗原或抗体结合））（（，后在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应其根据反应体系的不。

，同可分为直接法将标记的特异性荧光抗体直接加在抗原标本上，：，：经一定的温度和时间的染色用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，，室温下干燥后封片镜检间接法如检查未知抗原先用已知未标，。

、：记的特异抗体第一抗体与抗原标本进行）（反应用水洗去未反应的抗体再用标记的抗抗体第二抗体与抗），（，原标本反应使之形成抗原抗体抗体复合物再用水洗去未反应——，，的标记抗体干燥封片后镜检如果检查未知抗体则表明抗原标，。

、，本是已知的待检血清为第一抗体其它步骤的抗原检查相同根据。

，，抗原抗体反应后定量方法的不同可分为荧光抗体技术荧光显微镜技(：术抗原抗体反应后利用荧光显微镜判定结果的检测方法免疫荧：)。

，光测定技术抗原抗体反应后利用特殊仪器测定荧光强度而推算被，：测物浓度的检测方法。

荧光物质2.许多物质都可产生荧光现象但并非都可用作荧光色素只有那。

，些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料所用荧光物质介绍：。

异硫氰酸荧光素为黄色或：FITC）（fluoresceinisothiocyanate，橙黄色结晶粉末易溶于水或酒精等溶剂分子量为最大吸，。

389.4，收光波长为最大发射光波长呈现明亮，530nm520～495nm，～490的黄绿色荧光有两种同分异结构其中异构体型在效率稳定性、，、，Ⅰ与蛋白质结合能力等方面都更好在冷暗干燥处可保存多年是应用，，最广泛的荧光素其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感通常②：①，。

切片标本中的绿色荧光少于红色。

呼吸道九联检产品介绍一、九项呼吸道感染病原体抗体检测试剂盒采用间接免疫荧光，IgM法同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的抗体，IgM）（IFA，可检的病原体包括嗜肺军团菌血清型肺炎支原体热立克次Q：1、、体、．：0001文件编号红河州第三人民医院检验科版本：第一版2016生效日期：呼吸道感染病原体九联检操作程序主题内容页第乙型流甲型流感病毒腺病毒呼吸道合胞病毒肺炎衣原体、、、、用于呼吸道感染疾病的辅助诊断和型感病毒和副流感病毒。

31、2。

检测原理1.是基于待测样本中的抗体与吸附间接免疫荧光法图）（1（IFA）样本中存在的特异性抗体和抗原反应在载玻片上的抗原发生的反应，。

抗原在下一步骤中未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去，。

用免疫荧光显微镜观抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应-，察结果。

图1抗体检测试剂盒检测原理图九项呼吸道感染病原体1：IgM试剂盒组成及用途 2.组分成分和用途检测的物理载体覆有聚四氟乙烯并包被有针对检测，载玻片包装袋内有一袋硅胶以防潮物的特异性抗原。

，含有人血清及防腐用于证明试剂盒及试验的有效性，质控品剂。

含羊抗人检测用来吸附人避免干扰吸附剂，IgM IgG IgG3.1实验前准备）1操作步骤微量移离心管量筒烧杯实验所需物品准备 3.、、、1000ml：1000ml荧光显微镜盖玻片水平摇床恒温箱液器温育湿盒洗瓶。

、、、、、、蒸馏水中加入瓶粉末倒入烧杯中洗液的准备将PBS2），，：11L PBS备用摇匀直至完全溶解配好后储存在。

2-8oC，将恒温箱调至使用前将所有试剂平衡至室温）3℃。

，37，实验步骤3.2血清加入即样本的稀释按比例稀释血清标本）115μL15μL1:1，：阴阳性对照不需要稀释中PBS。

吸稀释后的血清加入用吸附剂处理稀释后的血清将）2L30μ150μL：处理后的血清彻底混匀阴阳性对照不需吸附剂处理附剂中。

，。

以防干扰检测分钟除去沉淀要离心。

，10-15在一个载玻片的吸附剂处理过的血清在载玻片的每孔中加）3。

15μL在另一个载玻片的每孔中加每孔中加入不稀释的阳性对照，15μL不稀释的阴性对照入。

L15μ分钟温育将载玻片放入湿盒中）4。

90℃37，用洗液的缓慢水流冲洗载玻片避免直接冲入孔内后浸）5，（PBS）泡在中并放置在水平摇床上轻轻摇动分钟将载玻片用蒸。

10PBS馏水缓慢水流冲洗避免直接冲入孔内）。

（载玻片自然晾干）6。

每孔加入结合物溶液不需稀释）7）。

（15μLFITC将载玻片放入湿盒温育分钟）8。

3037℃，重复和的洗涤步骤）9。

76加几小滴封闭介质小心盖上盖玻片）10。

，尽快用荧光显微镜在倍放大率下观察结果如果不能立即观）11。

400察可将其避光放置于不超过小时。

2-8oC，24结果判断．4有效性判断4.1每一次试验都应设立阳性和阴性对照以确认试验和试剂盒的，有效性观察到的荧光模式应为：。

阳性对照腺病毒流感病毒呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳、：、性质控的细胞出现苹果绿细胞核胞浆或胞膜荧、1-15%光在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着（色的合胞军团菌衣原体或立克次体中所有的细菌、；）呈现出苹果绿荧光支原体对阳性质控在细胞外围呈现；苹果绿色荧光。

阴性对照军团菌肺炎衣原体和立克次体无荧光支原体腺病、、：，毒甲型和乙型流感病毒呼吸道合胞病毒和副流感病、、毒的细胞呈现红色。

．样本结果判断4.2阳性结果可以观察到腺病毒流感病毒呼吸道合胞病毒或副流感、、：病毒对阳性血清的细胞的细胞核胞浆或胞膜出现、1-15%苹果绿色荧光在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时（观察到着色的合胞军团菌衣原体或立克次体中所有、；）的细菌呈现出苹果绿色荧光支原体对阳性血清在细胞外；围呈现苹果绿色荧光。

阴性结果可观察到军团菌肺炎衣原体和立克次体无荧光支原体、：，、腺病毒甲型和乙型流感病毒呼吸道合胞病毒和副流感、、病毒的细胞呈现红色。

检验结果的解释4.3每一批产品在放行前都要经过严格的内部质量控制检验1)。

）（Q.C.质控品科溯源到经过内部确认的参考血清盘。

如果所有细胞或第十孔出现荧光表明存在抗核和抗细胞抗体不）2，能判断为阳性应用其他方法进行检验当质控孔中吴荧光时一定要。

，查明原因。

由于非军团菌感染的病人中经常出现交叉抗体军团菌阳性的结）3，果需结合临床症状综合评价建议做较高稀释度的检测来提高阳性预。

测值。

与说明书中所列结果不同不能判为阳性）4。

在初次感染和再次感染的过程中和抗体有不同的表现）5IgM。

IgG方式初次感染时几乎在所有的情况下和均出现早IgM（，IgM IgG：于出现而再次感染时可能会出现在许多疾病中病人。

IgM，；）IgG：0001文件编号红河州第三人民医院检验科版本：第一版生效日期：2016呼吸道感染病原体九联检操作程序主题内容页第个一般情况下在感染后而的一生都可能存在高低度的2-3IgG，IgM是近期感染的有效标志物因此月存在血清中。

IgM，抗体阴性及阳性结果的荧光染色图谱九种病原体）6：IgM阳性结果荧光图谱：阴性结果荧光图谱：在使用本5.产品中所需注意事项如下：本产）1仅限专业人员使用品用于体外诊断。

，严格按照程序进建议用户仔细阅读和理解说明书在使用前）2，，特别是样本和试剂的正确吸行操作才能获得可靠的检测结果。

温育的时间控制对获得准确结果都很重要取以及仔细的洗板。

、载玻片要平衡至室温应将所有试剂平衡至室温另外使用前，，后再打开。

每一次试验都应设立阳性和阴性对照以确认试验和试剂盒的）3，有效性观察到的荧光模式应与说明书要求相符合否则检验，。

无效。

洗涤时注意不要直接对着孔直接冲洗以免冲洗掉已经固化反）4，的应复合物。

单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断应采集）5。

双份样本急性期和康复期同时检测来观察血清转化或抗体）（水平的明显升高。

仅使用试剂盒内的组分不要混用不同试剂盒或不同厂家的试）6，剂组分只有吸附剂封闭介质和载玻片可与其他批、。

、PBS次试剂盒通用其它组分同批次可以混用使。

IFA，VIRCELL用时最好在无菌条件下操作试剂以防微生物污染仅使用。

，试验所需量的吸附剂质控血清和结合物剩余的试，、PBS、剂不要倒回瓶中溶解后储存在一般为个月，oC4。

PBS～28使用前需检查如出现浑浊请勿使用。

，每步操作必须使用干净吸头仅使用干净的耗材最好是一）7，，次性使用的耗材。

包装如有损坏请勿使用）8。

切勿用嘴吸移液管加样）9。

本试剂盒中的吸附剂结合物和质控血清含有动物源性物质）10，、质控血清还含有人源性物质尽管本试剂盒中的人血清质控品。