是原生质体培养最令人瞩目的应用
克服有性杂交不亲和、雄性不育、多胚性干扰及花期不遇等常规 育种中的问题
实现远缘物种与近缘栽培种之间的遗传物质的转移
实现核基因的重组与细胞质基因组的重组，特别是在转移线粒体 及叶绿体控制的有益性状方面，具有得天独厚的优势
已经获得了具有优良性状的作物品系
要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组 织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一
完整植株
愈伤组织
无菌试管苗
悬浮细胞
2 原生质体分离的基本方法
机械分离法
在高渗溶液中，是植物细胞质壁分离，机械切割细胞壁，在质壁 分离复原时，原生质体从切口处释放
酶解分离法
采用可以消化细胞壁的酶（如纤维素酶、果胶酶等）处理移除细 胞壁，释放原生质体
包括原生质体的分离、培养及植株再生过程
红豆草原生质体培养
原生质体培养的意义
基础理论研究 体细胞杂交 遗传转化 无性系变异及突变体的筛选 细胞器的分离与导入 种质资源保存
基础理论研究
便于开展因细胞壁存在而难以进行研究的课题 在单个细胞水平研究细胞壁的再生、细胞膜的通
机械分离法
早期使用较多 仅限于具有较大体积、
液泡化的细胞 原生质产量低 很难得到完整原生质体
酶解分离法
常用酶类 酶液配制 酶解分离原生质体
酶液配制
酶溶剂：一般可以采用原生质体培养基或特殊配制
渗透势：去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的 渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、 洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者 比细胞内渗透压略大些葡萄糖、甘露醇或山梨醇等
遗传转化
排除细胞壁上的核酸酶阻止外源DNA进入细胞的作用 使原生质体利于从外界摄取DNA、染色体、细菌、病毒及细胞
器、蛋白质等 对单个原生质体进行准确操作，避免出现嵌合体 可以获得大量均一的原生质体，利于转化成功及条件筛选 已经成为遗传工程较为适宜的转化体系，特别是在瞬时表达方
成功 通过原生质体获得再生植株的植物约有300余种，其中有20多种为我国
首先报道
二：原生质体的分离
原生质体供体的选择 原生质体分离的基本方法 原生质体的纯化 原生质体活力的检测 影响原生质体分离的因素
1 原生质体供体的选择
植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤组织 和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料
胶体性质
胶体是物质的一种分散状态，一种或几种物质以1-100 nm大小的颗 粒分散于另一种物质中
带电性与亲水性 扩大界面 凝胶作用 吸胀作用
液晶性质
3 原生质体培养定义及意义
原生质体培养（Protoplast Culture）：
利用去掉细胞壁的原生质体为外植体，离体进行细胞培养，以获得 再生植株及细胞产物的培养方法
pH：纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以5.4及5.8 为宜；混合使用时pH5.4-pH5.6为宜。但对于细胞来说， pH6-7较为适宜
过滤：酶液配制后需以0.45 μm微孔膜过滤除菌，而不可采 用加热灭菌法
酶解分离
方法： 一步法是将材料在2l一28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理 2—24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶 脱壁而释放原生质体
原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质 膜所包围的裸露细胞
包括细胞膜及膜内细胞质及其它具有生命活性的 细胞器
特点：
无细胞壁，质膜直接与外界接触，利于摄取外来遗 传物质
便于进行细胞融合，形成杂交细胞 仍具有全能性
2 原生质体的性质
物理性质
张力 黏性及弹性 流动性
种质资源的保存
低温保存，具有细胞低温保存的所有优点 对低温伤害对细胞内部结构伤害的研究提供了便利的材料
4 原生质体培养的研究进展
1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词 1892年，Clercker首次以机械方法从藻类中分离到原生质体 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功 1971年，Takebe 首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株 1985年，Fujimura 第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株 1986年，Spangenberg 单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得
酶解时间：酶解时间几十分钟至几十小时不等、以原生质体游离下 来为准 酶浓度 供体材料比例 酶解温度
酶解条件 酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几 下。 对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上， 低速振荡以促进酶解
第六讲：植物原生质体的分离与培养
主要内容
原生质体培养的概念、意义及研究进展 植物原生质体的分离 植物原生质体的培养 原生质体培养实例
一：原生质体培养的概念、意义及研究进展
原生质体 原生质体的性质 原生质体培养概念及意义 原生质体培养的研究进展
1 原生质体（Protoplast）
面
无性系变异及突变体的筛选
无细胞壁的保护，对外界理化因子的诱变更为敏感，突变频率 高
突变后，可以通过有丝分裂保持下来，并一直维持纯系
细胞器的分离与导入
以原生质体为材料，温和破碎质膜，可以分离到完整的细胞 器，如叶绿体、线粒体、细胞核甚至染色体等，用于细胞器的 结构、生理生化功能研究，以及分子生物学分析提供了便利条 件
透性及离子转运、细胞分裂及分化等 以原生质体制备膜包小泡，研究物质运输及贮藏
等 生殖细胞原生质体利于研究花粉离体萌发机理、
发育过程、机理及调控，发育过程中的细胞骨架 的变化及花粉壁的形成；精卵体外融合及培养等 作为抗寒、抗热等的材料，为早期筛选抗性植株 提供材料，节省时间，空间及资源
体细胞杂交