杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或 悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶 植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等） 也可用完全展开的叶片作材料。
二、 酶解处理
1. 酶解液准备：由于植物细胞壁的主要成 分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的， 所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤 维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%。在配酶 解液时可以用原生质体培养基作溶解剂， 也可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。
原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间 粘连；
原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观 察单个原生质体的生长过程。
2. 固体培养 （平板培养）
含原生质体的固体培养基
35℃左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体 溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂 糖凝固后，就成一薄层。
进行平板培养时，要注意混合时培养基的温 度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培 养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。 特点：原生质体被固定，易观察、统计原生质 体的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物 比较麻烦。
苜蓿原生质 体分裂
苜蓿原生质体形成细 胞团 6 weeks
8 weeks
苜蓿原生质体 再生植株
转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株
夜来香原生质体植株再生
1天
7天
5天 10天
4周
5周
7周
单倍体烟草原生质体 培养与植株再生
杨树原生质体培养植株再生
7000,000cells/g fresh leaves 25000cells/ml; NH4NO3-free MS+5 M 2,4-D+ 0.05 TDZ M . PE: 34.7% at day 14
Tomato-potato hybrid
第二节 原生质体的分离
要进行原生质体培养和操作，就必需 有大量高质量的原生质体。分离原生质 体主要采用酶解法。
酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原 生质体。酶解法分离原生质体的效率高， 用少量的材料就可以得到大量完整的原 生质体，已成为分离原生质体的最主要 方法。
CPW=Cell-Protoplast Wash Medium
KH2PO4 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KI
27.2 mg/L 101.0 mg/L 148.0 mg/L 246.0 mg/L 0.16 mg/L
Cu SO4·5H2O 0.025 mg/L
为了保持释放出来的原生质体的活力和膜 稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境 中。因此，酶解液中 必须加入渗透压调节
GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响
GFP=绿色荧光蛋 白
PEG介导的甜橙原生质体转GFP
Sothern杂交分析 PCR分析
3. 体细胞杂交（somatic hybridization）： 由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原 生质体可以相互靠近，发生融合。2种不 同植物体细胞发生融合的过程，称为体细 胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞， 再通过植株再生就可能创造出新的植物个 体。
剂。
常用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和 山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体 用什么浓度，可根据材料的水势来确定。
酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进 行灭菌，并且随配随用。
2. 酶解：将植物材料放入酶解液中、释放 出原生质体的过程。
叶片、幼茎和根等材料要切成小片； 叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心 后再酶解。
原生质体活力（%）=发荧光的原生质 体数/原生质体总数×100
FDA
FDA光素双醋酸酯
细胞核
完整、有活力 的原生质体
第三节 原生质体培养
原生质体制 备好后，用 培养基将原 生质体调至 一定的密度 （最低起始 细胞密度以 上），及时 地进行培养。
在适宜的培养条件下，原生质体数 小时后开始形成新的细胞壁，在显微 镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为 方形、多边形等。约24-36h后，原生 质体开始发生第一次分裂；以后随着 细胞分裂，原生质体就形成细胞团， 进一步诱导出植株。
植物原生质体培养
第一节 原生质体的用途
• 植物原生质体 (protoplast)是 没有细胞壁的 裸露细胞，它 在一些研究方 面具有独特的 优势。
1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、 细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程 与机理等问题的良好实验体系。
2. 转基因的良好受体：与外源DNA（如质 粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外 源DNA，并整合到染色体上，从而实现 对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株 再生就可得到转基因植物。