第七章 植物原生质体的分离与培 养
• 7.1原生质体培养的意义及分离技术—原生质体制备 • 7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细 • 胞杂种的鉴定与筛选
植物原生质体培养和细胞融合
概念及研究进展 原生质体的分离与培养
原生质体融合
第一节 原生质体培养的意义及分离技术
原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
0.6mL 0.45M蔗糖
含原生 ❖ 优点：可以收集到数 质体带 量较大的纯净原生质
体，同时避免收集过
不连续梯度法
程中原生质体因相互 挤压而破碎。
原生质体鉴定
❖ 低渗爆破法 ❖ 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)
原生质体活力测定
❖ 形态识别
形态完整、富含 细胞质、颜色新 鲜的正常球形， 放入低渗溶液中， 可正常膨大。
Protoplast
飘浮法
❖ 采用比原生质体密度大的高渗溶液 （蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生 质体漂浮在液体表层的纯化方法。
❖ 优点：
可以避免分离的原生质体因震荡被 组织碎片撞击而破损。
所用药品简单，成本低。
❖ 缺点及补救措施：
对离心力要求比较严格，掌握不好， 原生质体则不易漂浮。可采用不同浓 度和不同离心速度分次漂浮的方法。
❖ 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
影响原生质体数量和活力的因素
❖ 供试材料及预处理方法 ❖ 酶解条件：
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
酶解分离法 机械分 离 法
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预
处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体 收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤 口处可释放出完整的原生质体。
❖ 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少， 能够用此法产生原生质体的植物种类受到 限制。
❖ 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 质膜稳定剂 ❖ 分离条件：
Organelle, DNA uptake
Cell cloning
意义
❖ 植物细胞育种中的核质替换 ❖ 细胞质杂种的获得 ❖ 远缘杂交创造新物种细胞 ❖ 细胞器的互作研究
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
来源
生产厂家
纤维素酶类
Onozuka R-10 Cellulysin
绿色木霉 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA
Driselase
Irpex lutens
Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan
不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
应用
Regenerative ability
Cell differentiation
Ontogenic processes
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
原生质体分离的方法
酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合
等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞 壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
❖ 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、 崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶 [Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。
酶
❖ 亚原生质体(subprotoplast)
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一 些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。
❖ 核质体(nuclearplast)
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微 小原生质体。
❖ 胞质体(cytoplast)
酶
来源
生产厂家
果胶酶类
Macerozyme R-10
Pectinase Pectolyase Y-23
半纤维素酶 RhozymeHP-150
根霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Sigma Chemical Co.
黑曲霉 Seishin Pharm. Co.
原生质体活力测定
❖ 荧光显微镜识别(FDA法)
FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有 极性，能自由穿过细胞 质膜。活细胞内FDA可 以被酯酶裂解，将能发 荧光的极性部分释放出 来。荧光素则不能自由 穿越质膜，在完整的活 细胞内积累。
使用浓度： 0.01%
原生质体活力测定
沉降法
❖ 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。
❖ 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互
挤压，常引起原生质体的破碎。
12mL
0.45M 甘露醇
碎片带
❖ 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。
Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Rohm and Hass Co.,
Rhiladelphia, UAS
酶解法的优缺点
❖ 优点：获得量大，适用广泛。 ❖ 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、
过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。
原生质体纯化的方法
漂浮法 沉降法 不连续梯度法