（3）纳滤法，其膜孔径为纳米级细孔，能截流的最小分子为 1nm，截留分子量为200—1000。所需要的压力在1.50Mpa。 可用于分子量相差无几的氨基酸之间的分离。
（二）：层析技术
• 层析技术用于目的 产品的高效分离和 纯化。
• 根据层析所使用的 介质不同，可分为
1：无机基质分离介 质
2：有机高分子基质 分离介质。
C：根据不同洗脱液的凝胶层析分类
• （1）水相淋洗凝胶过滤层析，简称凝胶过 滤。是指针对水溶性的生物大分子，按照 其分子大小进行分离的方法。
• （2）有机溶剂淋洗凝胶渗透层析，简称凝 胶渗透。是指针对脂溶性的生物大分子， 按照其分子大小进行分离的方法。
（ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ）亲和层析
• 亲和层析（AFC）是针对专一性结合的生物大 分子所进行的分离纯化方法。
1：无机基质分离介质
• 以多孔硅胶、可控孔径的玻璃、氧化锆、氧化铝、羟基磷 灰石为主要载体所制成的球形、或者无定形颗粒。 （1）可控孔径的玻璃的化学成份中SiO2，其表面可以通 过涂层来进行性能上的修饰。 （2）对于多肽药物的纯化分离，为了获得较高的分离效 率。常常选用孔径在25nm以上的球形硅胶介质。常用的亲 水凝胶介质，几乎都是二醇型化学键合硅胶。 （3）羟基磷灰石（HAP）与生物体有很好的相容性，已经 用于蛋白质、柱子酸的分离。球形的羟基磷灰石产品有 KOBECERAM、HASI，片形的羟基磷灰石产品有中科院生化 所生产的产品。羟基磷灰石（HAP）用于生物制剂分离纯 化的例子有：细胞蛋白、病毒和亚细胞颗粒、细菌蛋白、 精蛋白、重组蛋白、核蛋白、水解酶、异构酶、转移酶、 氨基酸、多肽、多糖。
第二章 关于生物制药技术
第一节 生物制药技术概论 第二节 原生质体融合技术
第一节 生物制药技术概论
• 一：酶蛋白抑制剂 二：基因工程药物 三：动物细胞基因在植物中的表达 四：基因重组疫苗 五：基因治疗药物
• 现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工 程、发酵工程四大类。
• 基因工程药物又涉及到酶蛋白抑制剂、基因重
（3）以葡聚糖凝胶作为骨架的离子交换树脂----如DEAESephadex，DEAE-Sephadex-A-25。
（4）以聚丙烯酰胺作为骨架的离子交换树脂---（5）以琼脂糖凝胶作为骨架的离子交换树脂----如CM-
Sepharose-CL-6B，DEAE- Sepharose-CL-6B。
C：离子交换剂的处理
（3）离子交换层析
• 目前能够在工业上加以应用的离子交换层析设备 有瑞典Pharmacia公司生产的----BioPilot中试层 析系统，其进样量可达10L。
• 全自动BioProcess标准层析系统，其流速可达420升/小时。
• A：离子交换剂 • B：离子交换剂的类别 • C：离子交换剂的处理
• 2：真空干燥法 • 3：冷冻干燥法
第三节：原生质体融合技术
2：有机高分子基质分离介质
• 常用的有机高分子基质分离介质有： （1）苯乙烯—二乙烯苯共聚物----属于交联体性质，常用的
有Mono-Q、Mono-S介质。 （2）N-乙烯吡啶共聚物，属于亲水性凝胶体性质，常用的有
TSK-gel-DEAE-5PW、TSK-gel-SP-5PW、TSK-gel-CM-5PW。 （3）聚甲基丙烯酸酯介质。 • 根据层析方法不同，又可分为： （1）纸层析 （2）薄层层析 （3）离子交换层析 （4）凝胶分子筛层析 （5）亲和层析
• （2）化学反应萃取：萃取剂和溶质之间发生化学反应
• （3）浸取
• （4）超临界流体萃取
（1）液-液萃取
• 是利用一种溶剂将生物产品 从发酵液中提取出来的过程。
• 萃取设备有离心萃取器：
连续微分接触式离心萃取机、 逐级接触式离心萃取机
• 有机溶剂萃取用于青霉素G、 红霉素、四环素、氨基酸的 提取
B：离子交换剂的类别
（1）以聚丙乙烯及其衍生物为骨架的离子交换树脂----如商品 树脂Dowex（美国）、Zerolite（英国）、Amberlite（美 国）、上海树脂厂生产的#704、#724、#732、华北制药厂生 产的101树脂。
（2）以纤维素、或者微晶纤维素作为骨架的离子交换树脂--如羧甲基纤维素（CM-纤维素）、磷酸基纤维素（P-纤维素）、 磺乙基纤维素（SE-纤维素）、二乙氨基纤维素（DEAE-纤维 素）。
二：细胞破碎技术
（一）物理方法 （二）化学方法 （三）新型技术和方法
（一）物理方法
1：研磨法----细胞在玻璃球、或者钢球之间被 碾碎。
2：捣碎法----在韦林氏捣碎机中，细胞被彻底 捣碎。
3：高压匀浆法----细胞被强近性地通过小孔而 剪碎。
4：超声波破碎法----利用超声波的空穴作用来 破碎细胞。
• 离子交换剂在使用时，要用起始缓冲液充分洗涤，以达到 所要求的离子浓度和PH值。 （1）阳离子交换剂应采用阴离子型缓冲液，如磷酸、乙酸、 柠檬酸等等酸性缓冲液， （2）阴离子交换剂应采用阳离子型缓冲液，如Tris，胺盐、 吡啶等等。
（4）凝胶分子筛层析
• A：凝胶层析的骨架介质 • B：凝胶层析介质的主要产品的品牌 • C：根据不同洗脱液的凝胶层析分类
5：表面活性剂增溶溶解法----采用洗涤剂破坏细胞壁， 使内含物释放出来。常用的洗涤剂有：（1）十二烷基 苯磺酸钠阴离子洗涤剂，（2）含有铵盐、或者氯化十 八烷基三甲基季铵盐的阳离子洗涤剂，（3）脂肪醇聚 氧乙烯醚的非离子型洗涤剂。
6：噬菌体作用法----
7：电离辐射法----
（三）新型技术和方法
• 实例： 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系提取淀粉酶和蛋白酶，收率高达90%。 聚乙二醇-4000/磷酸酯从 E.coli 提取人生长激素，聚乙二醇/磷酸盐提取α-1-干扰 素和β-干扰素。
• 金属亲和双水相萃取、双水相萃取-电泳技术、羟基纤维素取代聚乙二醇
细胞匀浆液
加入葡聚糖或盐，再加PEG
第一步双水相萃取
下相 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上相 产品
盐
第二步双水相萃取
静置分层
下相 核酸、多糖
杂蛋白
上相 产品
加盐 第三步双水相萃取
静置分层
下相 产品
上相 PEG、杂蛋白、色素
三步双水相萃取酶流程图
四：分离纯化技术
（一）：膜分离技术 （二）：层析技术 （三）：电泳技术
（一）：膜分离技术
1：渗透法 2：反渗透法 3：超滤技术 4：电渗析法 5：多孔陶瓷膜分离法 6：渗透汽化法
组疫苗、单克隆抗体、基因治疗药物。
第一节 生物制药技术概论
• 一：从DNA→mRNA→Pr • 二：细胞破碎技术 • 三：提取技术 • 四：分离纯化技术 • 五：灭菌技术 • 六：干燥技术 • 七：基因工程原理
一：从DNA→mRNA→Pr
• 1：DNA的半保留复制 • 2：DNA转录成mRNA • 3：mRNA逆转录成DNA • 4：mRNA转译成蛋白质 • 5：蛋白质在细胞内的加工和修饰
• 亲和层析常用的介质和载体有： （1）葡聚糖， （2）琼脂糖， （3）聚丙烯酰胺， （4）交联聚苯乙烯， （5）交联聚甲基丙烯酸酯， （6）亲和性高聚物。
（三）：电泳技术
• 1：纸电泳 2：醋酸纤维膜电泳 3：凝胶电泳----淀粉凝胶电泳，琼脂糖凝胶电 泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4：聚焦电泳----密度梯度电泳，等电点聚焦电 泳，亲和电泳。
A：离子交换剂的性质
• 离子交换剂是一种不溶性的固体物质，由二部份组成： （1）一部份是不溶性的骨架， （2）另一部份是通过静电吸引在骨架上的离子。离子部 分可以与溶液中的同性带电基团发生交换。
• 离子交换剂的骨架由不同的材料所组成： （1）硅酸铝， （2）多糖， （3）天然的聚合物。
• 离子交换剂所吸附的带电基团有： （1）酚基、羟基、羧基、磺酸基---形成阳离子交换剂， （2）氨基、芳香氨基----形成阴离子交换剂。
（2）化学反应萃取
发酵液 冷却至10℃，滤去菌丝体 用10%硫酸调节滤液至pH2.0-2.2 加入醋酸丁酯，将青霉素逆流萃取至醋酸丁酯相中 利用pH7的磷酸缓冲液将青霉素逆流萃取至水相中 用10%硫酸调节水相至pH2.0-2.2，将青霉素再次逆流萃取至醋酸丁酯相中 加温至15 ℃，加入醋酸钾，形成青霉素钾盐结晶 离心过滤，得到湿结晶
• 离子交换剂在使用之前必须经过前处理，以除去杂质、并 使得交换剂充分溶胀。方法是先将离子交换剂在水中充分 浸泡1—2天，或者在沸水中煮沸4—5小时，然后用酸、碱 反复处理。所用酸碱的浓度为0.5mol/L。 （1）阳离子交换剂经过碱洗→水洗→酸洗→水洗的处理序。 （2）阴离子交换剂经过酸洗→水洗→碱洗→水洗的处理序。
5：快速冰冻融化法----
（二）化学方法
1：渗透冲击法----在细胞液中加入2倍量的纯水，由于渗 透作用，细胞外的水分进入细胞内，导致细胞膜胀破， 而将内含物释放出来。
2：干燥处理法----
3：自溶法----
4：酶处理法----多采用溶菌酶进行处理。此外，还有链 霉菌酶、白细胞酶C也可用于进行酶处理。
• 根据电泳的操作方式不同，可将电泳分为： 1：园盘电泳， 2：平板电泳， 3：连续凝胶电泳， 4：连续流动电泳。
五：灭菌技术
• 1：干热灭菌法 2：湿热灭菌法 3：紫外线灭菌法 4：过滤灭菌法 5：化学灭菌法
六：干燥技术
• 1：烘干法 （1）喷雾干燥 （2）气流干燥 （3）沸腾干燥 （4）鼓式干燥
3：超滤技术
（1）微滤法，其滤膜的孔径为0.05—2.0um之间，可阻留分 子量为20-100万的物质，所需要的压力在0.1Mpa以下，适 用于细菌、微粒的过滤，
（2）超滤法，也称为错流过滤，其滤膜的孔径为0.0015— 0.20um之间，可阻留分子量为3-50万的物质，所需要的压 力在0.1--0.3Mpa，适用于大分子蛋白质与小分子有机物的 分离，