• 荧光标记的DNA链按从小 到大的顺序被毛细管电泳 分离。
• 激光诱导的荧光终止剂被 检测器识别，直接阅读DNA 的核苷酸序列
DTCS Kits
…(Store at –20 °C )
Standard Kit
– Sequencing Reaction Buffer – dNTP Mix – ddUTP, ddGTP, ddCTP, ddATP Dye Terminators – Polymerase Enzyme – Sample Loading Soln (SLS)
仪器性能
• CEQ 基因分析系统是一个全自动的系统，能够测定经过 Beckman Coulter 染料标记试剂处理的DNA样品的碱基序列和 片段长度。 四色染料标记终止反应试剂盒用于对样品进行碱基 序列分析。染料标记引物则用于对样品产生的片段长度进行分析。 • CEQ8000 可一次接受 1个 96 孔板。包括标记 DNA 片段的每 排 8 个样品（样品设置）自动变性，接着被毛细管电泳分离。 每次分离之后，在 8 根毛细管中的可替换媒介（分离胶）都被 自动替换。分离胶是由一个容易替换的胶管供给的，它能有效的 供应 1 块96孔板。 • 检测是在四个光谱信号中由激光诱导的荧光决定的。分离之后， 8 根毛细管中的每根产生的原始数据信号都自动处理产生高质量 的碱基序列或片段序列。原始数据和分析数据储存在数据库里， 都能够以与普通分析应用程序兼容的格式输出。
测序过程: DNA Sequencing with GenomeLabTM
1. 分离纯化模板DNA* 2. DNA模板定量分析* 3. 测序反应* 4. 测序反应后纯化* 5. On-line变性* 6. 毛细管电泳和检测* 7. 数据分析*
分离纯化模板DNA
• 1) 应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到 相应的质粒模板或者PCR产物； • 2) 将DNA储存在灭菌水里如ddH2O, 18.2M ΩH2O超纯水； 注意：不要使用DEPC处理的水，水中不能有 EDTA，否则将抑制测序反应 • 3) 通过紫外分光光度计定量DNA模板，DNA模 板的浓度应该> 0.1ug/ul； • 4) 通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量。
经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进
电泳方法的改进:电泳方法的改进主要采用毛细
管电泳法。毛细管电泳是被分离物质在毛细管中 的电泳。1992年，Matnies等首先提出陈列毛细管 电泳法，采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只 毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出 350bp。DNA序列分析效率可达6000bp/h 。
准确定量DNA模板是测序反应中十分重要的一步
测序反应
测序反应后纯化
去掉反应产物中的dNTP,ddNTP和盐分 • 乙醇沉淀 (利用96孔板离心机）
A
Mg++ Mg++
T
Mg++
T
G
T
Mg++
A
G C
A T
C
A
Mg++
C G
A
Mg++
T
测序反应后纯化
纯化得到 DNA 测序反应产物
DNA测序仪检测
DNA测序仪的原理及应用
上海交通大学分析测试中心 侯敬丽
内容
• DNA测序原理 • CEQ8000 DNA测序仪 • 基因测序系统的应用
引
– – – – – 基因组DNA: 染 色体 质粒DNA: 细菌 细胞 线粒体DNA:胞浆 人工染色体DNA: BAC YAC cDNA
双脱氧链末端终止法
1977年，Sanger等人发展建立起来的一种DNA 测序方法。 基本原理： 双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似 于正常dNTP的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，将 延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单 链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四 组，每组按一定比例加入一种 (ddNTP)，它能随机 渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各 种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸， 可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。
G
A T C
CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCC
CEQ8000 DNA测序仪
CEQ8000DNA测序仪硬件预览
Capillary Array
PMT
Filter wheel
Detection window
Diode lasers
Automated Sample Denaturation and Injection
经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进
标记物方面的改进：由于放射性同位素对人
体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质 来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银 染法、荧光标记物等化学发光物。在双脱氧法 测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产 物，最后通过酶显色反应或者荧光信号显示出 测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素 方法检测容易、安全、快速、费用也低。
DNA测序仪测序原理
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意
Sanger DNA测序仪的发展历程
1977: Sanger DNA法测序概念被提出
1986: Hood and Smith 荧光标记ddNTP被用于电泳 1987: 第一台自动测序仪产生 1990: 毛细管电泳被应用在DNA测序上 2003: 人类基因组测序工作完成
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意
双不仅具有化学测序法的 优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有 一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特 异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬 菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶 解片段为引物，在模板链的不同部位引导合成， 从而确定出噬菌体DNA的核酸序列。然而，对于大 量存在着的天然双链DNA分子，因没有良好的制备 产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧 链末端终止法的应用程度。
+
Gel Cartridge
Beckman CEQ8000 Start menu
View a SEQ Result
Alignment Analyzed Data Quality Parameters Base Sequence Raw Data Current Voltage
质粒和PCR产物测序