分子生物学讨论三之
遗传病的诊断与肿瘤基因治疗
遗传病的基因诊断
一、什么是遗传病
• 遗传病是指完全或部分由遗传因素决 定的疾病，常为先天性的，也可后天 发病。
遗传病的类型
• 1、染色体病或染色体综合征：遗传物质的改变在 染色体水平上可见，表现为数目或结构上的改变。 • 2、单基因病：指一对等位基因的突变导致的疾病， 分别由显性基因和隐性基因突变所致。 • 3、多基因病：涉及多个基因起作用，与单基因病 不同的是这些基因没有显性和隐性的关系，每个 基因只有微效累加的作用，因此同样的病不同的 人由于可能涉及的致病基因数目上的不同，其病 情严重程度、复发风险均可有明显的不同，且表 现出家族聚集现象，环境的影响较为显著。
镰刀状红细胞贫血（Hbs）
• 异常血红蛋白β链的第6位谷氨酸被缬氨酸 所代替。这个疏水氨基酸正好适合另一血 红蛋白分子β链EF角上的“口袋”，这使两 条血红蛋白链互相“锁”在一起，最终与 其他血红蛋白链共同形成一个不溶的长柱 形螺旋纤维束，使红细胞扭旋成镰刀形。
诊断方法
• 镰刀形细胞性贫血症的基因诊断可采用 PCR-限制性内切酶谱分析法。 • 先用PCR从患者基因组DNA扩增含突变位 点的珠蛋白基因片段。 • 再选择适当的限制性内切酶水解PCR产物, 根据酶切产物在电泳图谱上的片段数量和 大小做出判断.也可与特意的寡核苷酸探针 进行Southern印记杂交分析,根据杂交图谱 做出判断.
脆性X染色体综合征基因诊断
•常用的方法： （1）PCR—ASO （2）DNA连锁链分析 （3）Southern印迹杂交法 （4）PCR扩增
成年型多囊肾病
• 成年型多囊肾病是一种常染色体显性遗传病，发病率高， 约1000人中有1名致病基因的携带者，起病较晚，多在30 岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿，临床表现为腰 疼、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结石等，最终 可导致肾功能衰竭和尿毒症。 • 诊断：本病基因定位在16p13，与α珠蛋白基因3’端相 邻，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发 病机理也尚未阐明。因此，只能用连锁分析来进行基因的 发病前诊断和产前诊断。由于通过家系分析，已证实 APKD的致病基因与α珠蛋白基因3’端附近的一段小卫星 DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)紧密连锁，而 后者在人群中具有高度多态性，因此可以通过RFLP连锁 分析进行诊断。
4.限制性片段长度多态性
• 该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的 特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产 生限制性片段的特性。 • 如果重排、缺失或者核苷酸置换使内切酶识别 序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不 是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别 位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA 序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产 生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用 同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时， 产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段 这种变化即可作为诊断指标。
发展过程
• 1、利用连锁分析和关联分析定位遗传病致病 基因； • 2、利用分子杂交技术进行遗传病的基因诊断； • 3、利用PCR技术进行遗传病的基因诊断； • 4、基因芯片用于基因诊断； • 5、利用外显子组捕获技术诊断单基因遗传病； • 6、利用全基因组（GWAS）关联分析定位及 诊断多基因遗传病易感基因
7.生物芯片
• • 又称为基因芯片(gene chip)、DNA微阵列
(DNA microarray)
DNA芯片技术基础是核酸分子杂交
应用微电子加工工艺，在玻璃、塑料、硅片等材 料上制备用于生物样品分离、反应或分析的微细结构 目前主要有两大类：
1. 生物活性微阵列 (bioactive microarray) 2. 基因芯片 (gene chip), DNA微阵列 (DNA microarray)
甲型血友病的基因诊断
•1. 1.F Ⅷ基因到位的DNA印记分析： 1）将基因组用限制性内切核酸酶消化 2）用特异探针杂交，放射自显影分析 •2. F Ⅷ基因突变直接检测： 1）依赖于F Ⅷ基因内或旁侧的多态性的连锁分析 2）RFLP连锁分析 3）VNTR分析 4）STR连锁分析 对于甲型血友病进行基因诊断首先寻找有无基因到位，其 次利用基因内的遗传标志进行连锁分析，最后采用PCR— SSCP或PCR—DGGE分析。
二、基因诊断
• • • • • • 1.基因诊断概念 2.基因诊断特点 3. 基因诊断应用范围 4、基因诊断的发展过程 5、基因诊断遇到的问题 6、遗传病基因诊断的注意事项
基因诊断定义
• 某些受精卵或母体受到环境或遗传等的影 响，引起的下一代基因组发生了有害改变， 产生了疾病，为了有针对性的解决和预防， 故需要通过实验室的基因诊断、基因分析 才能得到确认。又称DNA诊断或分子诊断。
3.单链构象多态性
• 单链DNA呈现一种由内部分子相互作用 形成的三维构象，这种构象由碱基顺序决 定。碱基变异则构象改变。而构象影响了 DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度 但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的 不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带 可被银染或者荧光标记引物检测，然后用 DNA自动测序进行分析。
包括多肽、蛋白质、病毒、 细胞等。 蛋白质芯片可直接从体液中检测生物分子（免疫芯 片只需少量样品可一次完成对成千上万种抗原或抗 为最重要的生物芯片，广泛用于基因表达谱分析、 体等致病因素或生物样品的检测分析 )。 新基因发现、基因突变及多态性分析、疾病诊断、 药物筛选、基因测序等。
9.环介导等温核酸扩增技术
脊髓小脑性共济失调
• 脊髓小脑性共济失调是以小脑性共济失调为主要症状的 常染色体显性遗传性疾病，病理改变以小脑、脊髓、脑干 变性为主，临床主要特征为小脑性共济失调，可伴有构音 障碍、震颤、锥体束征以及痴呆等。 • 诊断：依据神经系统临床检查的程序来判断患者是否存 在小脑及脊髓神经失调的临床体征，然后会查问他的家族 史（包括已故的亲人），最后结合磁共振（MRI）及基因 测试，排除其他累及小脑和脑干的变性病，才能判断患者 是否患上脊髓小脑性共济失调。
• 其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物,利用一种链置换DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 ℃左 右) 保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应
10.免疫组织化学诊断
• 对于某些基因表达水平发生改变的疾病 可以采取免疫组织化学方法进行诊断，优 点是在不改变细胞结构的情况下，对基因 表达终产物——蛋白质水平及细胞中的部 位进行分析
6.单核苷酸多态性和全基因组关联分析
•单核苷酸多态性： 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的 变异所引起的DNA序列多态性。
全基因组关联分析——英 文名字叫Genome-wide association study简称 ——GWAS 全基因组关联分析— —是指在人类全基因组范 围内找出存在的序列变异， 即单核苷酸多态性 （SNP），从中筛选出与 疾病/性状相关的SNPs。
三、基因诊断方法
• • • • • • • • • • • 1.核酸分子杂交 2.聚合酶链反应 3.单链构象多态性分析 4.限制性片段长度多态性连锁分析 5.DNA序列测定 6.单核苷酸多态性和全基因组关联分析 7.生物芯片 8.WESTERN免疫印迹 9.环介导等温核酸扩增技术 10.免疫组织化学诊断 11..外显子组捕获技术
遗传病的基因诊断
以血红globinopathy）是由于 血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白 病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋 白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所 引起的一组遗传性血液病。 • 临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血 症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引 起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀。
• 外显子捕获(exon trapping) 是构建一种载体， 从其插入片段中识别和回收外显子序列， 从而克隆目的基因。
遗传病的基因诊断
————典型案例
主要内容
• 甲型血友病
• 脆性X染色体综合征 • 成年型多囊肾病 • DMD/BMD的缺失型 • 脊髓小脑性共济失调
甲型血友病
•血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血 性疾病。其共同的特征是活性凝血活酶生成 障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后 出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生 “自发性”出血。 •血友病可分为甲型、乙型、丙型和血管性 假血友病 4 种。其中甲型发病率占人类先天 性血液系统疾病的 85% 。甲型血友病，即因 子Ⅷ促凝成分（Ⅷ：C）缺乏症，也称 AGH 缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传 递，男性发病。 •甲型血友病的基因诊断主要鉴定患者家系 中的携带者或对未出生的胎儿进行产前诊断。
异常血红蛋白病
• 镰刀状红细胞贫血（Hbs） • 不稳定血红蛋白病（unstable hemoglobinpathies） • 血红蛋白M病（HbM） • 氧亲和力改变的血红蛋白病
地中海贫血
• α地中海贫血（α-thalassemia,简称α地贫） • β地中海贫血（β梩halassemia,简称β地贫）
基因诊断的特点
• • • • 高特异性 高灵敏度 早期诊断性 应用广泛性
基因诊断应用范围
• 1.检测病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病等 • 2.诊断先天遗传性疾患，产前诊断——优生 学 • 3.检测后天基因突变引起的疾病，如肿瘤 • 4.其他比如亲子鉴定，法医物证
基因诊断的发展过程
1976年美籍华裔科学家简悦威应用液相DNA 分子杂交技术成功地进行了镰形细胞贫血症 的基因诊断 ——标志着人类遗传性疾病诊断开始进入 基因诊断的新时代
限制性内切酶
• • • • • • 采集制备血液DNA 内切酶MstⅡ消化 电泳 转膜 P32标记的β珠蛋白cDNA杂交 放射自显影
PCR/限制性内切酶
• • • • • • 设计引物 PCR扩增 产物进行限制性内切酶酶切 电泳 EB染色 直接观察