• 例如:
– FVIII基因 ST14(DXS52)位点 (60bp)n – DMD基因intron 44、45、49、50中 (CA)n – PAH基因 intron3中STR(4bp)n
• 优点: 群体中等位基因数目多，杂合子频率高。
第三代遗传标记：单核苷酸多态 （Single nucleotide polymorphism，SNP）
4
5 1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
(3) PCR----DGGE
• 变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE） • Tm值----DNA双链50%解链温度。 • Tm值主要与碱基组成相关。 • PCR扩增后的DNA，在变性梯度由低到高的聚丙 烯酰氨凝胶电泳过程中，Tm值低的DNA片段先 解链，电泳速度变慢 一个碱基差异也能改变 Tm值导致泳动速率改变 产生泳动变位，能检 测已知，未知点突变。 • 检测突变率比PCR-----SSCP高。
DNA自动测序
• 应用如上原理，不同的是：
① 4种不同荧光染料标记的dNTP掺入酶促反 应(不用分4个反应体系)。 ② 经过毛细管凝胶电泳分离(不用分4个泳道)。 ③ 激光分析和计算机处理，直接标出碱基序 列。
焦磷酸测序
焦磷酸测序检测结肠癌KRAS基因突变
下一代 “克隆” 测序
5、DNA微阵列（DNA芯片）
• 生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。 • 肌电图：肌源性改变等。 • 1987年Kunkel等克隆DMD基因，定位于Xp21， 全长2400kb，含79个外显子，cDNA长度为14kb。
• 在杂交测序基础上发展起来的：
① 大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针 有规律地排列在指甲大小的芯片上----制作寡核 苷酸阵列。 ② 将待测的DNA，RNA或cDNA用荧光标记后在 DNA芯片上与探针杂交。
③ 用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算 机处理荧光信号，得出所需信息。
High-resolution melt curve analysis (HRM)
• 基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百 ~1kb之中有一个。
• 应用于：
– 疾病的关联分析
– 基因功能鉴定
– 基因发现和制图
– 候选基因发现
连锁分析举例
I 3
4.2 7.0
I2 4.0 7.0
4.0 7.0
4.0 7.0
4.0 7.0
II 1 4.2 9.7 4.0 7.0 4.2 7.0
PCR Mst II
A … … CC↓TGAGG … … 56 bp 54 bp S … … CCTGTGG … … 110 bp
（2）ASO探针杂交法--检测已知点突变
• 等位特异性寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide probe，ASO）以点突变为中心 合成20bp左右的一对探针：
4、DNA测序
• Sanger法-----双脱氧核苷酸末端终止法。
• 双脱氧核苷酸不能形成5’磷酸和3’OH之间的 磷酸二脂键（因3’也脱氧）而终止反应。
• 4个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP， ddTTP，将产生不同长度（在A，G，C，T处随 机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离 呈梯状带型，自下而上是5’ 3’被合成的 DNA链顺序。
检测点突变
• 已知点突变检测：
1、RFLP 2、ASO探针杂交法 3、等位特异性PCR 4、PCR----SSCP
• 未知点突变检测：
1、PCR----SSCP 2、PCR----DGGE 3、DNA测序 4、DHPLC
5、PCR-----DGGE
（1）RFLP方法---检测已知突变
• 基因较大片段缺失或插入 酶切片段长度改变。
第二代遗传标记：数目可变的串联重复 （Variable number tandem repeat，VNTR） • 大约几十bp长的碱基序列在人群中其重复的拷贝 数不同所产生的多态，一般在非编码区中。
– 小卫星DNA(6~28bp)n – 微卫星DNA(2~6bp)n ，也称STRP（small tandem repeat polymorphism）
• 引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长 度。 • 该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷， 目前自动化操作。
PCR扩增
（1）PCR----RFLP
• PCR扩增后酶切，检测点突变或多态。
（2）PCR----SSCP
• 单链构象多态（single strand conformation polymorphism, SSCP）：DNA单链在非变性胶 中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关。
• 基因点突变正好发生在某限制酶识别位点 切点消失或增加 酶切片段长度改变。 酶
• 酶切图谱法检测的缺点:
① 不直接影响酶切点的突变不能检测到。 ② 产生的片段大小太相似也不易被检测到。 • 特异性扩增含酶切位点的PCR扩增片段，再经酶 切后电泳检测----更简便,快速,也能弥补缺点②。
镰状细胞血红蛋白（HbS）
3、PCR技术 （Polymerase chain reaction)
• 1985年美国cetus公司的Kary Mullis创建， 80年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔 化学奖。 • 模拟生物体内的DNA复制，在体外DNA聚 合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。
步骤：
变性
20----30周期 复性 延伸
II 2 4.2 9.7 4.0 7.0
连锁分析的优点
• 不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内 或近旁DNA多态标记就可以分析。
• 缺点:
1、必须要有先证者以及家系中相关各成员的 DNA才能分析。
2、携带者是杂合子时才能分析。 3、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源 染色体交叉互换导致误诊的可能性。
基因诊断
主要内容
一、基因诊断概念 二、基因诊断基本原理及常用技术
1、核酸分子杂交 2、探针标记 3、PCR技术 4、DNA测序 5、DNA微阵列（DNA芯片）
三、基因诊断方法 四、基因诊断-------遗传病产前诊断
一、基因诊断概念
传统诊断法: 表现型 推测 基因型。 基因诊断法: 基因型 推知 表现型。 检测核酸 分析 特定基因 判断 基因型。
• 长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同 构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。 • 能检测已知和未知点突变。
PCR-SSCP过程
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 自显影 ↓ 结果分析
基因诊断特征: 1. 检测DNA不受被检测来源的限制。 2. 症状前诊断成为可能。 3. 对遗传病可进行分子水平再分类----遗传异质性 的分子水平阐明。
二、基因诊断基本原理及常用技术
1、核酸分子杂交
双链DNA
变性 加热,强酸,
单链
复性 探针
杂种DNA
强碱,变性剂
• 探针: 一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列, 作为工作状态的探针必须是单链。 • 常用探针种类: 基因组DNA, cDNA,人工合成的寡 核苷酸。
四、基因诊断-------遗传病产前诊断
1、甲型血友病（Hemophilia A）：FVIII因子遗传 性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病. • 发病率：男性的1/5000~1/10000，XR。 • 症状: – 自然或轻微外伤后出血不止。 – 皮下、关节、肌肉出血----关节强直、劳动力丧 失。 – 颅内出血可危及生命。 • 根据血浆中FⅧ浓度可分为轻、中、重度。
（3）Northern 印迹杂交
• 检测RNA的分子杂交技术
• 提取组织总RNA oligodT mRNA 琼脂糖凝胶电泳分离 转移 含甲醛的 预杂交
探针
杂交
洗膜
放射自显影。
• 检测特异mRNA大小和表达量。
（4）原位杂交及荧光原位杂交
（Flurescence in situ hybridization，FISH）
Identification of copy number changes by array comparative genomic hybridization (CGH)
三、基因诊断方法
1、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。 能作直接诊断的条件： 遗传方式已知 病因基因或cDNA已克隆分离 突变性质与疾病关系已阐明 基因突变类型： 1、DNA碱基置换(点突变) 2、DNA片段的缺失、插入、重复等 3、动态突变
核酸分子杂交操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段 预杂交 杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
检测杂交信号
（1）斑点杂交 （Dot blotting hybridization）
• 主要用于基因缺失和拷贝数改变。
• 应用： 1）混合样品DNA鉴定 2）基因缺失检测 3）基因表达分析 • ASO探针（等位基因特异性寡核苷酸）---检测已知点突变。
– 与正常序列杂交的探针 – 与异常序列杂交的探针 • 优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变 也能检测。 • 缺点: 突变位点及性质清楚的前提下才能合成 ASO探针，只能检测已知点突变。
2、间接方法---连锁分析法
• 基因内或基因近旁DNA多态为遗传标记进行连锁 分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色 体而作出诊断。
• • • •
染色体标本上，组织切片上分子杂交 原位杂交----3H标记探针 FISH-----荧光素或生物素标记 应用于基因定位，染色体数目及结构异常 诊断。 • 组织切片上的FISH----mRNA水平表达及一 些病原体感染诊断。