基因诊断在遗传病监测中的应用目前发现人类遗传性疾病有3 000多种，如果仅依靠以往的染色体分析技术或对基因产物与代谢物的测定，我们只能对其中为数极少的一部分疾病在发病前或产前进行诊断。

因为许多基因的表达有时相性和组织特异性（如有些基因在胎儿早期并不表达、苯丙氨酸羟化酶只在肝组织中表达）。

用常规的方法采集的胎儿标本或其他人体材料，常常不能测出这些基因的产物或代谢产物。

然而，作为构成机体基本单位的细胞，无论其来自何种器官或组织，它们的基因组成却是完全一致的；虽然在某些特异化的组织细胞中某些基因并不表达，但那些基因的突变却存在于一切细胞之中。

如果采用基因分析的方法进行监测，在个体发育的任何阶段，以任何一种有核细胞为检材，基因的缺陷都能被监测出来。

这就是近十几年来飞速发展的重组DNA技术给遗传病的早期（症状前和出生前）诊断带来的福音。

重组DNA 技术不仅极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，而且同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。

自从1978年发现第一个限制酶切位点多态性并应用于遗传病（镰形细胞贫血）的基因诊断以后，能够进行基因诊断的病种不断增加，方法和途径越来越多。

一、基因突变的类型造成基因突变的原因很多，有自发的也有外界理化因素的影响。

从DNA序列改变的角度来看，不外乎单核苷酸的取代和DNA片段的插入或缺失两大类型。

所产生的后果取决于突变发生的位置和性质，只要影响了基因表达过程中的任何一个环节，都会导致遗传性疾病。

归纳起来如表1所示表1 基因突变及效应一览表DNA序列的改变突变发生的部位mRNA水平的表现基因产物的改变举例1.大片段缺失或插入整个基因缺如缺如α地中海盆血基因片段异常功能缺陷DMD、BMD2.少数核苷酸的缺失或插入外显子与内含子接界拼接异常缺如3的整数倍外显子缩短或延长异常（氨基酸缺失或插入）Hb Leiden非3的整数倍外显子缩短或延长异常（移码突变）β地中海盆血3.单核苷酸取代启动子减少减少β地中海盆血剪接信号剪接异常缺如β地中海盆血PolyA信号不稳定减少β地中海盆血密码子中性突变正常密码子错义突变氨基酸取代异常血红蛋白密码子或内含子剪接异常缺如或移码突变β地中海盆血密码子无义突变肽链提前终止β地中海盆血终止密码肽链延长，量减少Hb Canstant spring起始密码β地中海盆血缺如β地中海盆血二、遗传病基因诊断的途径在了解了基因突变的各种类型之后，对应用何种方法来诊断它们便很容易理解了。

例如某种遗传病是由于基因缺失造成的，可通过监测受检者是否缺失该基因来直接判断其基因型。

如果某遗传病是核苷酸取代造成的点突变，便可以通过监测该突变的方法（ASO探针或酶切位点监测）来进行诊断。

如果致病突变或病因还不清楚，但有相关的基因探针或已知其与某位点的RFLP紧密连锁，便可进行家系分析，通过该位点状态的连锁分析进行监测。

下面根据不同的情况，举例说明基因诊断中常用的方法。

1.直接监测（1）应用基因探针或PCR进行缺失型基因监测部分α地中海贫血和三分之二以上的杜氏及贝氏进行性肌营养不良（DMD及BMD）是整个基因或基因片段的缺失造成的。

应用基因探针（基因组DNA或cDNA探针）进行Southern印迹杂交，如果某些杂交片段消失或片段长度改变（不是由于限制酶识别位点的改变造成的RFLP），即可判定受检者有基因缺失。

应用近年来发展起来的PCR技术，也可进行缺失基因的监测。

根据缺失发生区域的DNA序列，合成一对引物进行基因扩增（反应体系中必须包含有另一无关DNA片段的扩增引物，作为反应是否成功的内对照），通过凝胶电泳检查，如果没有扩增片段，便说明该基因或该DNA片段缺失，对α地中海盆血中的Hb Bart 水肿胎儿的产前诊断和DMD/BMD的产前基因诊断都是应用此法进行。

（2）造成特异限制酶切位点改变的突变基因的监测有时，某些“点”突变（一般为单个核苷酸的取代或少数几个核苷酸的缺失或插入）正好影响了某种限制酶的识别位点（丢失或增加），对这些与基因突变相关的酶切位点的改变，可用来进行突变基因的直接监测。

例如β珠蛋白基因密码子6处有一MstⅡ的识别位点（CC↓TGAGG），而在HbS病人的β珠蛋白基因，因其密码子6由GAG（谷氨酸）突变为GTG（缬氨酸），破坏了MstⅡ的识别序列。

使得正常的两个杂交片段（1.15kb,0.2kb）消失，而出现一个异常的1.35kb(1.15+0.2=1.35)片段。

许多实验室应用β-S基因的这个特异标志，直接用MstⅡ酶解β珠蛋白基因相应区域的PCR产物进行HbS病的产前基因诊断。

（3）突变位点特异性监测——ASO探针斑点杂交绝大多数“点”突变不改变酶的识别位点，但经DNA序列分析明确基因的突变的细节之后，可人工合成针对突变位点的特异寡核苷酸（allele specific oligonucleotide,ASO）探针，进行突变基因的直接监测。

ASO探针的长度一般为19个碱基，分别与被测定的突变所在区域的正常和异常DNA序列互补。

在一定的杂交和洗脱条件下，只要有一个碱基不匹配，就不能形成稳定的杂交链，正常探针只能与正常基因序列杂交而不能与突变基因的序列杂交，反之亦然。

1983年Conner等首先应用ASO探针进行镰形细胞贫血的基因监测，现在已广泛应用于β地中海贫血及其他遗传性疾病的基因诊断。

PCR技术的发明使ASO探针的使用更加快速简便。

用PCR产物进行斑点杂交，不仅降低了同源序列的背景干扰，而且降低了对探针放射强度的要求。

可以用非放射性物质进行探针标记，操作安全，并且不受同位素半衰期的限制。

目前对β地中海贫血、经典型PKU等基因的诊断，都是应用此途径。

2.间接分析监测致病基因——RFLPs连锁分析进行限制酶切片段长度多态性（RFLP）连锁分析，目前还是施行基因诊断的主要手段。

对于遗传性疾病，目前了解其病因的只是其中的一小部分。

即使对那些已经知道了结构基因的遗传病，由于其致病突变的细节（即核苷酸序列的改变）一时还不了解，还不能合成相应的寡核苷酸探针进行PCR/ASO监测。

更不用说那些目前连其遗传缺陷的生化机理尚不明确的遗传性疾病了。

对于这一类基因缺陷的监测，只能通过间接的途径，即应用RFLP连锁分析进行基因诊断。

一般说来RFLP分析所监测到的DNA多态性通常是中性突变，与基因的致病突变之间不存在连锁不平衡性，因此一个多态位点存在与否并不说明基因是否异常。

只有在特定的家系中才具有一一对应的关系。

多态性位点在基因连锁分析中的应用价值，除了它与致病突变之间连锁的紧密程度以外，还与它的杂合频率有关。

连锁越紧密所得结果越可靠；杂合频率越高应用价值越大。

我们用多态性信息量（polymorphism information contents,PIC）来衡量，PIC是指某一家系可以利用RFLP作为遗传标志进行基因连锁分析的概率；就整个群体而言，它是指在群体中利用这些RFLP进行基因诊断的诊断率。

有时单单分析一个多态性位点，还不能将某一家系中的致病基因所在染色体与正常染色体区分开来，必须分析多个位点的状态，综合起来才能获足够的信息。

我们将一条染色体上两个或两个以上与致病基因密切连锁的多态性位点状态的组合叫作染色体单倍体型（haplotype）。

无论是何种遗传性疾病，只要有与之密切连锁的RFLP位点（基因本身或邻近的DNA序列），便可应用核心家系成员（先证者及父母）的DNA进行RFLP分析，确立致病基因所在染色体与RFLP位点状态的连锁关系。

但只有在那些连锁关系明确、正常与异常染色体能够区别的家系中，才能对家系成员进行症状前或产前基因诊断。

（1）应用基因探针进行RFLPs分析应用基因探针（基因组DNA或cDNA探针）所监测到的RFLP位点在基因的内部或基因附近，它与基因突变位点之间连锁非常紧密，通常情况下很少发生重组（除非基因本身非常庞大，如抗肌萎缩蛋白基因，2300kb），因此非常可靠。

DNA序列已经明确的基因内或旁侧序列中的酶切位点的多态性状况还可以用PCR方法来监测。

PCR扩增后用相应的限制酶来酶解扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段是否被酶解成小片段；或者将PCR扩增产物进行ASO斑点杂交判断基因座的状态。

用基因探针直接和间接分析法可诊断的遗传病见表2和表3。

表2 用RFLPs直接分析法可诊断的遗传病（不完全统计）遗传病基因探针软骨发育不全Ⅱ型胶原蛋白肾上腺皮质增生症类固醇21羟化酶淀粉样多发神经病变前白蛋白抗凝血酶Ⅲ缺乏症抗凝血酶ⅢEhlers-Danlos综合征α1(1)胶原蛋白第10因子缺乏症第10因子A型血友病第8因子及合成寡核苷酸B型血友病第9因子高胆固醇血症低密度脂蛋白受体HPRT缺乏症HPRT免疫球蛋白k链缺乏症免疫球蛋白CkLesch-Nyhan综合征 HPRTMarfan综合征微纤维元基因FN1Ⅱ型成骨不全原α1（1）胶原蛋白地中海贫血α珠蛋白β珠蛋白合成寡核苷酸抗胰蛋白酶缺乏症合成寡核苷酸DMD、BMD 抗肌萎缩蛋白基因表3 用RELPs间接分析法可诊断的遗传病(不完全统计)遗传病基因探针淀粉样变性前白蛋白α1抗胰蛋白酶缺乏症α1抗胰蛋白酶载脂蛋白CⅡ缺乏症载脂蛋白CⅡ动脉粥样化载脂蛋白AⅠⅠ型生长激素缺乏症生长激素A型血友病第8因子B型血友病第9因子甲状腺机能低下甲状腺球蛋白高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因高脂血症载脂蛋白AⅠ高甘油三酯血症载脂蛋白AⅠLesch-Nyhan综合征 HPRT苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶β地中海贫血β珠蛋白血栓形成抗凝血酶ⅢDMD、BMD PERT87-8 P20（2）应用染色体DNA片段作探针进行RFLPs分析除了基因探针之外，还有一些探针是基因组DNA片段。

这些从基因组文库中分离获得的DNA片段，在确定了其能监测出某些限制酶的RFLP后，便可用作探针的候选者。

经过染色体定位，大致判定其是否与目前已知的遗传性疾病有连锁关系，然后再通过对此遗传性疾病家系的RFLP连锁分析和优势对数计分（Lod score），确定是否密切连锁。

如是，便可用作基因分析以至基因诊断的探针，如α-3＇HVR序列用于APKD 的基因分析（表4）。

表4 用DNA片段为探针监测的遗传病（不完全统计）遗传病基因探针肾上腺白质营养不良（adrenoleukodystrophy）Stl4成人型多囊肾α珠蛋白遗传性肾炎DXS3DSS1纤维囊性变LAM4-917脆X综合征第9因子5q-综合征C-fmsBechwith-Wiedmann综合征第11号染色体DNA片段猫叫综合征第5号染色体DNA片段成视网膜细胞瘤综合征第13号染色体DNA片段Wilms瘤第11号染色体DNA片段Wolf-Hirschhorn综合征第4号染色体DNA片段Huntington舞蹈病G8通过RFLP连锁分析，还可进行反向遗传学的研究，即寻找那些目前尚未获得的致病基因的DNA序列及其基因产物。