马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用霍晓辉;申永梅;刘国富;曹雪松【摘要】马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)P0是由开放阅读框1(ORF1)所编码,利用农杆菌介导的瞬时表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白(GFP)基因的16c烟草叶片发现PLRV-P0能够抑制由GFP mRNA引起的基因沉默,结果表明PLRV-P0是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子.通过序列分析发现PLRV-P0基因序列中含有两个重复的WG基序,我们将PLRV-P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸(W)点突变为丙氨酸(A)(命名为P0WA),构建植物表达载体pCAMBIA1300-CE-P0,pCAMBIA1300-CE-P0WA,农杆菌渗透注射本氏(Nicotiana benthamiana)烟草叶片,通过荧光显微镜观察发现PLRV-P0和AGO 共同注射后有绿色荧光出现而PLRV-P0WA和AGO共同注射后则没有绿色荧光出现.研究结果初步表明,PLRV-P0能够和AGO蛋白发生相互作用,重复的WG基序是其与AGO蛋白相互作用的关键氨基酸.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】7页(P70-76)【关键词】马铃薯卷叶病毒(PLRV);P0蛋白;抑制RNA沉默;AGO蛋白;相互作用【作者】霍晓辉;申永梅;刘国富;曹雪松【作者单位】聊城大学生命科学学院,聊城252059【正文语种】中文RNA沉默是一种由同源序列引起的特异RNA降解过程。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近来发现的一种重要的基因沉默现象，通常由双链RNA 介导。

1990年Napoli首次提出植物中的RNA沉默也称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。

高等植物对于病毒侵染有保护自身的防御机制，当病毒侵染植物时，由病毒RNA和mRNA介导的转基因会引起植物对病毒的抗性，称为病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）。

它是转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）一种特殊形式。

但是，为利于病毒侵染，植物病毒也同时编码一种蛋白用来对抗RNAi，这类蛋白可以用于抑制RNA沉默的各个步骤，称为 RNAi 抑制因子［2］。

据报道已鉴定了50余种病毒编码的RSS，例如马铃薯Y病毒属（Potyvirus）中的蚜传辅助性蛋白酶（help component-proteinase，HC-Pro）［3］，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）编码的2b，马铃薯X 病毒（Potato virus X，PXV）编码的p25、马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV）属编码的P0以及甘蔗黄叶病毒编码（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）的 P0 等［4］。

基因沉默抑制因子干扰基因沉默的机制有多种形式：抑制siRNA的积累；抑制因子与siRNA的结合，使之不能与蛋白核酸复合体结合形成RISC（RNA诱导的沉默复合物）；抑制双链RNA的形成；抑制因子与基因沉默核酸蛋白复合体相结合，阻止转录后基因沉默的发生。

AGO蛋白是RNA沉默途径中一个关键蛋白，AGO蛋白可以与小RNA的引导链及其他蛋白质组装形成的RNA诱导的沉默复合体（RISC）。

病毒编码的RSS与AGO相互作用的研究表明，AGO作为RNA沉默路径当中的关键蛋白可能会成为很多病毒RSS作用的靶位点，AGO蛋白正确组装成RISC需要多种dsRNA结合蛋白的协助，因此推测许多RSS利用其含有的“AGO 钩”（GW/WG重复，甚至只含有单个GW或WG）与AGO的竞争性结合来抑制RNA沉默。

最新研究发现，抑制因子中含有的重复甘氨酸、色氨酸（GW/WG motif）是与AGO相互作用的关键氨基酸，基因序列中GW/WG重复二次至多次可以作为“AGO钩”（Ago hook）与AGO蛋白结合并在基因沉默中发挥作用［5，6］。

例如芜箐邹缩病毒（TCV）外壳蛋白P38中的二个GW重复是与AGO相互作用的关键氨基酸，而且P38与AGO互作的同时会影响DCL的表达［7］。

马铃薯卷叶病毒属于黄症病毒科家族的马铃薯卷叶病毒属中的黄化病毒组（Luteovirus），1916年被发现，是发现最早的马铃薯病毒，由多种蚜虫以持久性方式传播，而不能由机械传播，PLRV的分布主要局限于在寄主植株韧皮部维管束内，主要侵染茄科（如马铃薯、番茄等）植物。

据报道，在我国北方地区造成的马铃薯产量的损失约为30%-40%，严重时候可达到80%-90%。

PLRV基因组结构为等轴对称，直径约24 nm。

PLRV的RNA的碱基组成大体上为28%A、23%U、25%C与24%G。

PLRV的基因组含有8个ORFs，其中有部分ORF重叠，在通过选择性的识别起始密码后再经过移码、通读终止密码子及利用亚基因组等各种策略分别翻译各 ORF［8］（图 1）。

P0是由 PLRV的 ORF1所编码，它是病毒侵染植株后引起病症的决定性因子，并且是一种RSS。

图1 马铃薯卷叶病毒基因组结构目前已鉴定的马铃薯卷叶病毒属中的RSS只有马铃薯卷叶病毒（PLRV）、甜菜西方黄化病毒（BWYV）、南瓜蚜传黄化病毒（CABYV）和甜瓜蚜传黄化病毒（MABYV）编码的P0蛋白，但对其机制都还不清楚，而我们试图通过农杆菌瞬时表达渗透注射转GFP基因的16c烟草叶片研究PLRV-P0是否能抑制RNA沉默。

通过序列分析发现P0基因序列中含有两个重复的WG基序，我们首先将P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸（W）点突变为丙氨酸（A）（命名为P0WA），然后分别将P0和P0WA基因克隆到改造后的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-CE上，将 PLRV-P0，PLRV-P0WA分别和AGO共同进行农杆菌渗透注射野生型（N.ben）烟草叶片，并在荧光显微镜下观察PLRV-P0和AGO 及PLRV-P0WA和AGO共同注射后是否有绿色荧光的出现，从而确定PLRV-P0到底能否和AGO蛋白发生相互作用及其关键氨基酸。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料本氏烟草（Nicotiana benthamiana）以及转GFP基因的（16c）烟草种子由David Baulcombe教授惠赠。

1.1.2 菌种、质粒大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101，pWEIMING101载体均由本实验室保存，双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-CE以及重组质粒ASK-NE，ASK-CE，AGO-NE，pGR107P0WA均由本实验其他研究人员构建。

1.1.3 酶和试剂限制性内切酶（Xho I，Cla I，Sal I，Kpn I）和T4 DNA连接酶购自Promega公司；Taq DNA聚合酶及其缓冲液，dNTP购自TakaRa公司；胶回收试剂盒，质粒快速提取试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司；DNA分子量标准购自Fermentas公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 引物设计与合成根据GenBank中报道的PLRV-P0的基因序列，设计合成含有相关酶切位点的上下游引物并由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 目的基因的PCR扩增1.2.2.1 P0基因的PCR扩增以pER8的cDNA为模板，PLRV-P0 5'：GTTAGTCGACATGATTGTATTGACCCAGTCTG（下划线为Sal I酶切位点）；PLRVP0 3'：ACAGGGTACCTCATTCTTGTAATTCCTTTTGG（下划线为Kpn I酶切位点），1300-CE-P0 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（下划线为Cla I酶切位点）；1300-CE-P0 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下划线为Xho I酶切位点）为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系为：pER8的cDNA 模板1 µL，10 × PCR Buffer 5 µL（含 Mg2+），2.5 mmol/L 的dNTP 4 µL，10 μmol/L上下游引物各1 µL，Taq DNA聚合酶1 µL，Pfu 0.5 µL，加去离子水至总体积为50 µL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共30个循环；72℃延伸5 min。

然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2.2 P0WA基因的PCR扩增 PLRV-P0的第87-140位氨基酸的原序列如下（方框内为两个WG基序）：WGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGWG 。

以重组质粒pGR107P0WA为模板PCR扩增，将PLRV-P0的第87、140位的色氨酸（W）点突变丙氨酸（A），突变之后的序列如下（方框内为两个WG基序突变后）：AGLLCGTHPAIQIVGLTIVIKLDDPTTAAAYRSELLRVSSSSYIQNAAGLSNGAG 。

以pGR107-P0WA质粒为模板，1300-CE-P0W-A 5'：GTTAATCGATATGATTGTATTGACCCAGTC（下划线为Cla I酶切位点）；1300-CE-P0WA 3'：CACACTCGAGTTCTTGTAATTCCTTTTGGA（下划线为Xho I酶切位点）为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系为：pGR107-P0WA质粒DNA模板1 µL，10×PCR Buffer 5 µL（含Mg2+），2.5 mmol/L的dNTP 4µL，10 μmol/L上下游引物各1 µL，Taq DNA聚合酶1 µL，Pfu 0.5µL，加去离子水至总体积为50 µL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸5 min。

然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，胶回收试剂盒切胶回收PCR产物并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。