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核酸分子定 性检 测 技 术
定性聚合酶链式
反应通过定性检测调控基因或目的基因的存在来 显示转基因成分的存在 $ 它包括以下几种方法 ’
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普通 LPI 技术 $ LPI 包括三个基本步骤 %
-+-+. LPI/B1;1’84; 法 $ LPI 扩增后 % 借助 MN, 测序仪中基因片段扫描 !B1;1’84;" 的功能替代琼 脂糖凝胶电泳对 LPI 产物进行分析 $ 该方法可以 分辨出相差 $ T * 个碱基的 LPI 产物 % 从而准确
免疫吸附法 "$%&’( $! 并对几种检测方法的优缺点进行比较 %
% 关键词 & 转基因产品 & 检测 & 生物安全 & 基因芯片 % 中图分类号 & ’()*+# 69>4624;74@1 G131 69>8F>>16+ %()* +,%-#& @1;1798455A <:69?916 :3@4;9><> E3:6F87> #6171879:;#H9:>4?17A #@1;18=9E % 文献标识码 & , % 文章编号 & -""./00-.!!""#""$/""-*/". %!"#$%&’$& ’121345 6171879:; <17=:6> ?:3 @1;1798455A <:69?916 :3@4;9><> !BCD " E3:6F87> 4;6 7=193 4624;74@1 4;6
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竞争性 %&’ ! 在同一反应管中 " 未知含量
的待测模板和已知含量的内标模板 #竞争性模板 $ 用同一对引物同时扩增" 扩增后用内切酶消化
%&’ 产物 % 竞争性模板的产物可被酶解为两个片
段 "而待测模板不被切割 " 通过凝胶电泳或高效液 相可以将两种产物分开 "分别测定荧光强度 " 然后 根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数 &*+,-.//., 等"(000’12+34 和 564.7"8009$ %
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中国饲料
!""# 年第 $ 期
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中国农业科学院畜牧研究所 山 东 莱 阳 农 学 院 于忠娜 单 虎 苗向阳 韩荣伟 李建霞
% 摘要 & 本 文 介 绍 了 常 用 的 转 基 因 产 品 检 测 方 法 ! 包 括 针 对 核 酸 的 聚 合 酶 链 式 反 应 "!"## 和 针 对 蛋 白 质 的 酶 联
物沿膜板延伸 ! 延伸 "$ 这 0 个步骤重复循环 % 使模 板 MN, 的某一个靶序列呈特异性指数扩增 % 是其 他 LPI 技术的基础 $
-+-+!
多重 LPI 技术 $ 在 LPI 反应中使用一对
以上的引物 %目的在于同时扩增模板 MN, 中的几 个片段 $ 如果基因的某一区段消失 % 则电泳图谱上 相应的区带就会消失 $ 每种扩增产物的产量随着 反应中引物数量的增加而成比例减少 $ 该方法可 以同时检测多个突变或病原 ! 吕山花等 %!Q"! "$
是 NOP<B 法 % NOP<B 是将抗原与抗体反应的特异 性与酶对底物催化的高效性结合起来 %在测定时 " 受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应 " 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合 物与液体中的其他物质分开 " 再加入酶标记的抗 原或抗体 " 通过反应而结合在固相载体上 " 此时固 相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比 例 % 加入酶反应的底物后 " 底物被酶催化成有色产 物 "根据酶作用于底物后的显色反应 " 当抗原与抗 体结合时 " 借助于比色或荧光反应鉴定转基因成 分 " 酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成 正比 %
判定扩增片段的大小 $
即双链 MN, 膜板加热变性成单链 !变性 "# 低温下 引物与单链 MN, 互补配对 !退火 "#合适温度下引
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核酸分子定 量 检 测 技 术
定量检测是对原
万方数据
!""# 年第 $ 期
中国饲料
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料和转基因产品中的成分进行定量 ! 随着人们对 转基因食品重视程度的提高 " 加上所采取的 %&’ 法因其高灵敏度常伴有假阳性或假阴性现象 " 定 性检测方法已经不能满足需要 ! 为此 " 研究人员 在定性筛选 %&’ 方法的基础上 " 发展了不同的转 基因生物的定量 %&’ 检测方法 !
引物 & 内引物 $ 扩增 8$ " :" 个循环 % 利用该技术 检 测 转 基 因 大 豆 ’63?-3F ’.+-GHI 中 &FDJ.F4F4 基因和 H?64 终止子的方法都已确定 % 该方法具有 很高的特异性和灵敏度 " 检测限为 !" F/ @AB" 相 当于一般原料中含有 "KC( L " M)8 L 的转基因大 豆 % 采用套式 %&’ " 将外引物扩增的片段又经内 引物扩增 " 提高了反应的特异性和灵敏度 "能检测
因食品中特定蛋白质的酶标抗体 ! 目前商品化的 转 基 因 食 品 %&’() 检 测 试 剂 盒 只 能 检 测 少 数 几 种转基因食品 " 且一种试剂盒只针对一种特定转 基因产物 " 无法高剂量 # 快速地检测具有多种混合 成分的食品样品 !
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!"#$ 法
根据蛋白质等电点不同在 ,- 梯
度 胶 中 等 点 聚 焦 $./0121345.3 607/.89 "’%: % 将 其 分 离 " 然后按照分子质量大小在垂直方向或水平方 向 进行十二烷 基磺酸钠;聚丙烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 $(<(;=)>% % 第二次分离 ! 但如果要使双向电泳 能较精细地分离结果 " 组成双向电泳的两个单向 电泳所依据的分离原理应该有很大不同 ! 该方法 分辨率高 " 一般的 !;<% 能分辨 ?""" @ +""" 个蛋 白质点 " 但对于碱性蛋白质不能有效分离 $ 吕秀 华 "!""? %!
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试纸条法
与 NOP<B 法相比 " 试纸条法检测
蛋白质也是根据抗原抗体特异性结合的原理 " 不 同之处是以硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相 载体 % 对外源蛋白特异结合的抗体上联结了显色 剂被固定在试纸条内 " 当试纸条一端被放入含有 外源蛋白的植物组织提取液后 " 另一端吸水垫的 毛细管作用使提取液向上流动 " 当特异抗体与外 源蛋白相结合时 "便呈现颜色反应 % 试纸条上含有 两个 ) 捕获 * 区域 + 一个 ) 捕获 * 结合外源蛋白的抗 体蛋白复合物 "另一个 )捕获 *显色剂 % 当形成的夹 心复合物及未反应的显色剂被试纸条上的相应 ) 捕获 * 区捕获时 "这些捕获区显红色区带 % 当在试 纸条上只显示一条区带 & 质控线 $时 " 为阴性结果 " 表明不含有被检测的转基因蛋白 " 而当显示两条 带时则为阳性结果 " 表明含有被检测的转基因蛋
8)!):
<63=>.,? 杂交 % 该法于 80#$ 年首创 " 是将
核酸凝胶电泳 ( 印迹技术和分子杂交融为一体的 技术 % 被检的 @AB 分子用特定的限制性内切酶消 化后分成若干片段 " 经琼脂糖凝胶电泳分离后转 移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上 " 然后将膜放置在 含有同位素或其他标记的 @AB 探针溶液中进行 分子杂交 % 杂交膜显影后如果有条带出现 "则说明 被检测 @AB 片段与核酸探针具有互补序列 % 在基 因工程操作中 "它可以检测重组 @AB 分子中插入 的外源 @AB 是否为原来的目的基因 " 并验证插入 片段的分子质量大小 % 此技术已广泛应用于克隆 鉴定 ( 品种鉴定以及基因作图等方面 % 但此方法对 样品的质量和纯度要求较高 & 孙鑫 "!C"D’ 郑 云雁 和李小芳 "800E$%
8)!)!
荧光定量 %&’ % 荧光定量 %&’ 技术是在常
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酶联免疫吸 附法
蛋白质检测应用最多的
规 %&’ 基础上 " 添加一条标记了两个荧光基团的 探针 % 一个标记在探针的 $! 端 " 称为荧光报告基 团 &’ $’ 另一个标记在探针的 :! 端 " 称为荧光抑制 基团 &; $% 两者可以构成能量传递结构 "即 $! 端荧 光基团发出 的荧光可被 :! 端荧光抑制 基 团 抑 制 或吸收 % 当二者距离较远时 " 抑制作用消失 " 报告 基团荧光信号增强 % 荧光信号与 %&’ 产物同比增 长 " 随着 %&’ 产物的增加而增强 % 利用荧光信号 监测整个 %&’ 进程 " 最后通过标准曲线对未知模 板进行定量 &李少骞 "!""! $%
8)!)D
套式 %&’ % 即先后用两套引物扩增的 %&’