第11讲 动物细胞生物制药应用新民周刊2010,5.17-23.P76-92010.11.2：世界肺炎日（第2个）全球每年约有160万人死于肺炎链球菌疾病，平均每38秒1名5岁下儿童死于此病，1100万儿童因肺炎住院。

导致儿童死亡的头号杀手，并高致残：智力低下、癫痫（17%）、耳聋（27.7%）。

中国是10个肺炎发病率最高的国家之一，1/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占46.8%。

占西太平洋区的70%。

红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达86%。

1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗PPV23诞生。

2000年针对2岁以下儿童的7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世。

目前已经接种3亿剂，世界第一大单个疫苗。

肺炎链球菌发现100年后，真正安全有效的PPV7疫苗才大规模使用。

制造工艺非常复杂，约需要一年左右。

只有爱尔兰、美国两家工厂。

猪流感（Swine Flu），是猪群中发现的一种可引起地方性流行性感冒的正黏液病毒，属呼吸系统疾病，由甲型流感病毒(A型流感病毒)引发。

以往曾经发生人类感染猪流感，但未有发生人传人案例。

2009年4月墨西哥猪流感造成数150多死亡事件，并在多个国家蔓延。

病毒及病毒疾病甲型H1N1流感病毒H、N的意思世界卫生组织2009年4月30日建议使用“A/H1N1流感”的名称。

病毒根据抗原性的不同，可分为A、B、C三型。

根据血凝素(Hemagglutinin，H)和神经氨酸酶(Neyramidinase，N)的抗原特性，将A型流感病毒分成不同的亚型。

目前，有15种特异的H亚型和9种特异的N亚型。

病毒进入细胞：血凝素（H）能和细胞膜上的蛋白结合，在细胞上打开一个通道，使得病毒能进入细胞。

病毒要钻出宿主细胞：神经氨酸酶（N）通过“水解”的方式切断病毒和宿主细胞的最后联系，使病毒脱离宿主细胞。

首批36万支甲型H1N1流感病毒疫苗抵达新疆　2009-10-16SARS病毒SARS病毒属于冠状病毒科，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在80-120nm之间。

感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解，病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细胞外，多聚集成堆。

HIV病毒-艾滋病HIV是艾滋病病毒（humanimmunodeficiency virus）的缩写。

“人类免疫缺陷病毒”。

逆转录病毒，遗传信息存在于两个相同的RNA 单链模板中。

艾滋病是1981年发现的。

生存于人的血液中并攻击人体免疫系统。

把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而使整个人体免疫系统遭到破坏，最终人体丧失对各种疾病的抵抗能力而导致死亡。

2009年12月3日，国家食品药品监督管理局在监督检查中发现，江苏延申和河北福尔生物制药股份有限公司的7个批次人用狂犬病疫苗存在质量问题。

2010.3.17：山西疫苗事件《中国经济时报》首席记者：王克勤高温暴露疫苗垄断二类疫苗标签疫苗原山西省疾控中心信息科科长：陈涛安本节主要内容1.杂交瘤技术生产单克隆抗体2.病毒疫苗生产本节关键问题杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程一杂交瘤技术生产单克隆抗体问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？细胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。

体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传重组，在育种方面意义重大。

杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。

基础知识回顾（一）免疫学基础1抗原进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。

包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。

特点：外源性、结构性（分子具有表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。

2抗体P238动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。

互补性决定区（Complementaritydetermining region，CDR）VH和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位（Antigen-binding site）。

该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的多样性与特异性。

抗体产生的途径免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细胞包括B淋巴细胞——发育成浆细胞，分泌抗体，参与体液免疫，脾脏可以分泌。

T淋巴细胞——发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫，经胸腺分泌。

不能产生抗体，帮助B淋巴细胞产生抗体。

多克隆抗体与单克隆抗体动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。

一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。

问题的引出血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。

如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？很难离体培养B淋巴细胞。

（一）历史发现1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。

科勒（Kohler）米尔斯坦（Milstein）（二）杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydridoma technique）。

（三）单克隆抗体应用领域单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于生物学和医学研究领域：1.作为亲合层析的配体2.作为生物治疗的导向武器3.作为免疫抑制剂4.探针5.增强抗原的免疫原性6. 作为医学检验试剂视频：/v_show/id_XMTY1ODg5MDI0.html1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）三个过程。

如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。

2.骨髓瘤细胞的获得与培养骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。

通常采用HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系。

一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。

保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3.细胞融合（1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

（2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。

（3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。

加预热的不完全培养液，终止PEG作用。

（4）离心，弃上清，用20％小牛血清等轻轻混悬。

将融合后细胞悬液加入96孔板，100μl孵箱培养。

／孔，37℃、5％CO24 融合细胞的筛选融合后的细胞类型融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。

正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。

剩余：脾细胞与瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞和瘤细胞，其中后两种需进行特别的筛选去除。

HAT培养基筛选法培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。

筛选原理DNA的合成：正常途径：糖、氨基酸——核苷酸——DNA ，可以被氨基蝶呤阻断胸腺嘧啶核苷激酶（TK）补救途径：核苷酸前体 ——核苷酸——DNA次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）需要2种酶的参与（1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。

（2）融合所用的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。

两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。

融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK ，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。

5.克隆化培养将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。

找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。

6.分泌抗体的融合细胞的筛选酶联免疫吸附法（ELISA）EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成的抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

7.单克隆抗体的大量生产（1）实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107cells／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml。

待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。

采血量有限。

（2）腹水制备法腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。

也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。

腹水中单克隆抗体含量可达5～20mg/ml，这是目前最常用的方法。

（3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗杂交瘤细胞生物反应器培养液离心除去细胞，收集上清液提取抗体。

（五）人源化单克隆抗体简介鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限性:（1）不能有效地激活人体中补体和Fc 受体相关的效应系统（2）被人体免疫系统所识别, 产生人抗鼠抗体( Human antigen mouse antibody,HAMA)（3）在人体循环系统中很快被清除掉。