靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性
一、实验目的：
1. 测定土壤脲酶活性的意义。

2. 掌握测定土壤脲酶活性的原理和方法。

二、实验原理
靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+－N含量呈正比，线性范围为0.05~0.5mg/l之间。

靛酚蓝反应原理如下: NH3 + OCl——NH2 Cl +OH-
三、实验试剂
1） 10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。

2）柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

3）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。

将AB溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

4）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

5）氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。

四、实验过程
1.标准曲线的测定
吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。

从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，充分混合。

加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。

将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。

以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

2.土样中脲酶活性的测定
分别称取2g过1mm筛的风干土样于3个100ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。

放置15分钟后，加入5ml 10％尿素溶液和10ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇匀。

将锥形瓶放入37℃恒温箱中，培养24h。

培养结束后，用热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。

设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。

相当于其他实验中所做的空白对照。

分别吸取（）ml滤液于3个50ml比色管中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml 苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色（在1h内保持稳定）。

在分光光度计上用1cm比色杯，于578nm处进行比色测定。

土壤脲酶活性以24小时1g土壤中NH3－N的毫克数表示。

五、注意事项：
蒸馏水的要求——无氨水；
试剂加入的顺序;
测定时间的控制；
六、思考题
1.测定土壤脲酶活性的意义是什么？
2.试验中为什么加入甲苯？
3.测定土壤脲酶活性的其他方法包括哪些？。