花药培养应注意的问题
分化培养基为去除2,4－D，加入NAA或 KT。在分化培养基是，愈伤组织会出现 绿点，最后发育成绿色植株。此外，在 禾本科植物的花药培养中，常会出现白 化苗，目前还没有有效的控制方法。
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5 培养基成分
培养基成分包括无机盐、碳源、氨基酸、维 生素和植物激素等。它们对花药的培养的成 功率有明显的作用。先前是用已有的培养基， 如MS、Miller和Nitsch等，后来研制出适合不 同植物的专用培养基。
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（2）生理状态：花药供体植株的生 理状态，对花粉愈伤组织的诱导率有 直接影响。
对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而 言，大田植株比温室植株、主茎穗比 分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都明显 的要高。
花药培养应注意的问题
不同季节接种的花药愈伤组织诱导 率也有显著变化。如烟草、小麦早 期的花药比晚期的要好，愈伤组织 诱导率高，说明供体植株的生态环 境，特别是温度和光周期可能对花 粉发育及其对离体培养的反应有重 要影响。
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（3）花粉发育时期：不是任何发育时期的花粉 都可在离体培养时诱导产生愈伤组织或胚状体， 只有那些发育到特定时期的花粉，对离体刺激才 最敏感。
实验证明，烟草、曼陀罗和水稻的花粉从单核中 期到双核早期都可离体诱导产生愈伤组织。
小麦和玉米处于单核中期的花粉培养效果最好。 天竺葵和番茄分别为四分体和中期I的培养效果
最常用的方法是低温冷藏。具体做法是将带 有叶鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑 料袋套起，放在冰箱中冷藏。
花药培养应注意的问题
不同材料对处理温度的高低有不同的要 求，一般耐寒植物比喜温可耐受较低的 温度。低温处理时间视使用的温度而定， 较低的温度处理时间要短，反之则长。 烟草7～9度下处理7～14天，水稻7～10 度下处理10～15天，大麦3～7度下处理 7～14天，都可显著提高花药的出愈率。 但低温处理对小麦的效果不稳定物的花粉对离体培养有其特 定的、最敏感的发育时期。然而，对大 多数植物来说，单核期的花粉比较容易 培养成功。
检查和确定花粉的发育时期，通常将花 粉用醋酸洋红涂片观察，但对水稻和玉 米却用KI－I染色较好。
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2 预处理
为了获得最好的培养效果，在花药培养之前， 可先对其进行预处理。
花药培养的历史
利用离休培养花药的方法，诱导花粉形成单 倍体植株的工作始于1964年（Guha et al. ,1964）。
单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染 色体数目和配子体细胞染色体数目一致，对 单倍体植物进行染色体人工加倍之后，即可 得到同质结合的纯系，使育成的杂种不再分 离，缩短育种年限，加快育种速度。
花药培养应注意的问题
适合烟草的H培养基（1967）；适合于 禾谷类的N6培养基（1975）；适合小麦 的C17培养基（1986）、W14培养基 （1988）和马铃薯－II培养基（1978）； 适合水稻的合5培养基（1978）、通用培 养基（1980）和SK3培养基（1978）； 适合玉米培养的正14培养基和玉培培养 基（1978）；适合大麦的FHG培养基 （1988）等。
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用冷处理可以增加诱导频率，其原因是： 冷处理抑制纺锤体的形成，冷处理不能 诱导花药的发育，但它有助于培养花粉 的存活。并且阻止配子体分化，导致较 高频率的花粉发育。冷处理的作用是间 接的，因此不是离体花药成功培养的先 决条件。
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3 材料的表面灭菌 对花药表面灭菌的方法很多，常用的方
法有：用市售漂白粉饱和液浸泡10～15 分钟；用8～10%安替福民水溶液浸泡 5～10分钟；用0.1%升汞浸泡10分钟。 如果小花或花蕾包封严密，只须用70% 酒精进行仔细擦拭即可。
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4 获得花粉植株的一般程序
禾本科植物花粉植株的诱导，一般分二 步进行。先是将花药接种到含2,4－D1～ 2mg/l的诱导培养基上，形成愈伤组织。 后是在花粉愈伤组织产生后的10～15天， 长到直径1～2mm时，及时将其转移到分 化培养基上进行植株分化。转移太迟会 降低成苗率。
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（1）无机盐：特别是硝态氮和铵态氮的 浓度和比值，是影响花粉愈伤组织形成 的重要因素，无论是N6还是C17、W14、 FHG等都是通过大幅度降低培养基中铵 离子浓度和调整培养基中铵态氮和硝态 氮的比值而使培养效率大大提高。
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（2）碳源：作用有三，一是碳源，二是 能量，三是渗透压。蔗糖是较好的碳源， 烟草为3%，水稻为5%，小麦为10%， 玉米为12%。在大麦的花药培养中，麦 芽糖和纤维二糖的效果明显优于蔗糖。 用过滤灭菌的方法，用葡萄糖代替蔗糖 可明显地促进小麦花粉胚的形成和植株 再生。碳源种类和浓度的改变，还有很 多工作可做。
花药培养的历史
在我国花药培养和单倍体育种方面做了 大量的工作，如培养基的研制，雄核发 育机理，培育新品种等。由于花药培养 的方法日趋完善，培养效率也逐年提高， 使这一技术开始被广泛应用于常规杂交 育种，逐渐成为作物改良和新品种培育 的一个重要手段。
花药培养应注意的问题
1 材料的选择 用作花药培养的亲本植株的基因型、
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（3）植物激素：烟草可不用任何激素也 能产生再生植株。但禾本科植物花药培养 中，一般要加1～3mg/l的2,4－D，但在玉 米和燕麦的花药培养中，2,4－D反而会产 生抑制作用。细胞分裂素类物质（KT、BA） 可促进茄科植物的花粉植物的形成，但对 禾本科植物花粉的培养不是必要条件。一 般认为在诱导培养中加入KT有利于增强愈 伤组织的胚胎发生能力。
生长情况以及接种时花粉所处的发 育时期，对花粉植株的诱导频率都 有直接的影响。
花药培养应注意的问题
（1）基因型：实验证明，供体植株的遗传 背景对花药培养成败关系甚大。如水稻中 粳稻比籼稻容易培养，前者花粉愈伤组织 的诱导率平均可达10%，而后者只有1～ 2%。对各种基因型水稻的测试说明，花药 培养力（愈伤组织诱导率和绿苗分化率） 的顺序为糯型＞（粳×籼）杂种＞粳型＞ 籼型杂交稻＞籼型。可见基因型在花药培 养中起着关键的作用。