• 2. 将冻存的细胞液转移至新10ml离心管中，加入 5ml培养液。
• 3. 低速离心，1000rpm，10分钟。 • 4. 去上清，加新鲜培养液3ml。 • 5. 将刚复苏的细胞转移至培养瓶中，C02培养箱，
37 ℃培养。
复苏要点
• 快速解冻
– 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水 浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全 部融化（不要超过3 分钟）
实验十一、细胞的冻存与复苏
一、实验目的
1.初步掌握冻存与复苏的原理及其操作过程 2. 继续强化细胞无菌操作理念
二、实验材料与用品
（一）材料：Hela细胞
（二）试剂 培养液：1640培养液+15%小牛血清；胰蛋白酶消 化液：0.25%；冻存液、液氮
三、实验原理
• 细胞冻存的原理：当细胞冷到零度以下，可以产 生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓 度升高，并在细胞内形成冰晶。
–细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通 过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长 培养液的培养瓶。
四、实验步骤
一、细胞冻存方法
• 1.预先配制冻存液： 含10-30%血清培养基，10% DMSO。 • 2.取对数生长期细胞，胰酶消化后，加全培养基终止消化，
1000rpm离心收集细胞，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成 细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) • 3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷 冻日期。 • 4.冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存
透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少 胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 • 常用细胞冷冻保存液 10％DMSO ＋ 20％血清＋基础培养液 10％甘油＋ 20％血清＋基础培养液
细胞复苏原理及要点
–当细胞冷到-5至零度时，可以产生以下变化：细胞 器脱水，在细胞内形成冰晶，对细胞器有损伤，复 苏时应尽快通过该温度。
7、应在无菌条件下操作，注意操作要领，避免污染细胞。
注意事项
1、操作前，提前将操作间和超净工作台内紫外灯打开，消毒杀 菌30 分钟。
2、进操作间前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新 洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
3、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行。 4存复苏时，操作要带手套，防止冻伤。
• 冷冻保存要点
• DMSO液用培养液配好冰上预冷，避免因临时配制产热 而伤害细胞。
• 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微 生物污染。细胞浓度控制在：1×106-5×106/ml。
细胞保存条件 液氮罐
二、细胞复苏方法
• 1.从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃(或者 42 ℃)水浴中，使其融化（1分钟左右）。
• 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致 产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成 细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融， 目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
低温保护剂的应用的原理
1、在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效率 2、常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速