《发酵工程与设备实验》实验课程教学大纲实验名称：发酵工程与设备实验学时：32学时学分：2学分适用专业：生物技术、生物工程执笔人：程爱芳审定人：黄芳一一、实验的性质与任务实验课程作为发酵工程教学的重要部分，一直是课程建设的重点，建立一整套的实验管理体系，形成了我们学校实验教学的特色。

另外通过本课程的学习旨在培养学生的基本实验技能，掌握基本实验方法且能将理论运用于实践。

二、教学目标与基本要求使学生实验基本操作掌握扎实，熟悉发酵工程实验技术方法，了解发酵工艺生产基本流程，培养学生的综合实验技能。

四、实验教学内容及学时分配实验一实验准备知识和基本操作训练(4学时)目的要求了解发酵工程实验室技术的基本内容，掌握发酵工程实验室技术的基本操作。

主要实验仪器及材料试管、移液管、平皿、接种环、烧瓶、涂棒、棉花掌握要点几种棉塞的制作和基本的发酵工程实验室技术操作。

实验内容1、观看30分钟实验基本操作教学录像。

2、几种棉塞的制作（1）试管棉塞的制作（2）锥形瓶棉塞的制作（3）发酵瓶棉塞的制作3、几种器皿和用具的包扎（1）培养皿的包扎（2）移液管的包扎（3）其它用品的包扎：试管口、锥形瓶口、发酵瓶口4、发酵工程实验技术基本操作（1）平板操作：到平板、划线、涂布（2）斜面操作：斜面制作、划线、接块、穿刺（3）摇瓶操作：接块、接菌苔、接斜面孢子、移液等5、几种接种用具的制作（1）接种环的制作（2）涂棒的制作（3）接种铲的制作（4）接种针的制作（5）酒精灯的制作6、实验室10L小型发酵罐的系统组成及其使用讲解。

实验二产植酸酶黑曲霉的分离(4学时)目的要求1、掌握从自然界分离目的菌种的基本方法。

2、从土壤中取样分离产植酸酶黑曲霉菌株。

方法原理植酸即肌醇六磷酸酯。

植酸及其盐类是植物中磷的主要贮存形式，其贮存着植物总磷的60%～90%。

在营养研究中，发现植酸具有比较明显的抗营养作用，且不被人和单胃动物所利用，最终绝大部分从粪尿中排出体外，造成环境的磷污染。

植酸酶是催化植酸及其盐类水解成肌醇与磷酸的一类水解酶的总称。

植酸酶可将饲料或食品中的植酸及其盐分解成肌醇和磷酸，增加可利用磷的含量，抑制植酸对矿物质和蛋白质的亲和力，解除植酸的抗营养作用。

植酸酶广泛存在于小麦、大麦、玉米等植物的种子中，但含量较低。

细菌、酵母和丝状真菌等也是植酸酶的重要来源。

本实验利用选择培养基（透明圈法），从土样中筛选分离植酸酶的黑曲霉菌种。

主要实验仪器及材料1、土壤样品采集自稻米加工厂堆积米糠或谷壳处的土壤，或将少量谷壳和麸皮埋入土壤中2个月后取土样。

2、培养基（1）1%脱氧胆酸钠溶液。

（2）氯霉素注射液或氯霉素眼药水。

（3）筛选培养基0.2%植酸钙（没有植酸钙，可用0.14%植酸代替，用氢氧化钙溶液调pH5.5即可）、3%葡萄糖、0.5%NH4NO3、0.05%KCl、0.05%MgSO4·7H2O、0.003%MnSO4·4H2O、0.003%FeSO4·7H2O、2%琼脂、pH5.5～5.7。

（1）、（3）分开灭菌，120～122℃灭菌20min。

3、试剂与器皿培养皿、锥形瓶、试管、玻璃珠、涂棒、移液管、接种铲、无菌水等。

掌握要点筛选培养基及其用透明圈法从土壤中取样分离产植酸酶黑曲霉菌株的方法。

实验内容1、将灭菌好的培养基（3）按每L加（1）号液20mL，加（2）液若干，使最终每L含氯霉素50mg，摇匀，倒平板若干。

2、取适量土样加到已灭菌好带有玻璃珠并加有10～20mL无菌水的锥形瓶中，振摇几分钟。

3、用无菌移液管吸取0.5mL左右2样加到已凝固好的平板上，然后涂布均匀，于28～30℃培养箱中倒置培养3～7 d。

实验三产植酸酶黑曲霉的纯培养(4学时)目的要求学习制备马铃薯葡萄糖培养基的方法以及斜面接种技术。

方法原理马铃薯葡萄糖培养基是一种半合成培养基，可用于培养霉菌。

主要实验仪器及材料1、菌种：产植酸酶黑曲霉菌株（由实验二分离得到）；2、培养基：PDA培养基；3、器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。

掌握要点PDA培养基的配制及其斜面接种技术。

实验内容1、PDA培养基的制备（1）培养基配方马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、自来水1000mL、pH自然。

（2）操作步骤①称量去皮新鲜马铃薯200g切成1cm见方小块，放入烧杯中，加1000mL自来水，置电炉上煮沸20min后，用双层纱布过滤，取滤液备用。

②加入称好的葡萄糖、琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。

③趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。

分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。

④高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。

2、分离纯化菌株转接斜面（斜面接种）接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。

为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。

一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。

①在分离产植酸酶黑曲霉的平板上，选择透明圈明显、透明圈直径与菌落直径比值较大的、分离效果较好的单菌落，并作好标记。

②左手拿平板，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。

③左手将平板放下，拿起斜面培养基。

在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。

划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。

注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。

④灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。

接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。

⑤斜面置于28～30℃恒温箱中，培养3～7d观察结果。

实验四摇瓶发酵实验(4学时)目的要求学习和掌握摇瓶培养的方法方法原理在浸没培养过程中振荡的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。

摇瓶培养通常以特定生长条件下的培养物接种，也可用孢子接种。

振荡培养是建立深层发酵的开始，就一特定微生物而言，振荡培养时存在一最佳培养基配方和最佳培养基容量。

细胞或孢子接种浓度对试验的成功极为重要，不同的微生物细胞或孢子以及不同的振荡培养过程的接种浓度差异可能是十分显著的，且各自存在一最适浓度。

主要实验仪器及材料1、生产菌株黑曲霉（由前面实验分离选育获得）2、摇瓶发酵生产培养基：0.05%蛋白胨、2%葡萄糖、0.2%NH4NO3、0.05%KCl、0.05%MgSO4•7H2O、0.004%K2HPO4•3H2O、0.001%Fe2+、0.001%Mn2+ 、pH5.53、500m1三角烧瓶4、旋转式摇床掌握要点摇瓶接种技术以及摇瓶培养方法。

实验内容1、取干净500mL三角烧瓶，分装100mL培养基，用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1MPa下灭菌20min。

2、将成熟的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL无菌水，震荡成孢子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。

待发酵培养基灭菌后冷却到30℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2mL，每个菌种各接3只，标好记号。

3、置旋转式摇床（30℃、160r/min），培养4～6天。

实验五植酸酶酶活的测定(4学时)目的要求掌握植酸酶酶活的测定的方法。

方法原理植酸酶活性单位定义为：样品在植酸钠浓度为5.0mmol／L、温度37℃、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm下进行比色测定。

主要实验仪器及材料1、乙酸缓冲液c(CH3COONa·3H2O)为0.25mol／L。

2、植酸钠溶液c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol／L。

3、硝酸溶液：1:2水溶液。

4、100g／L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL容量瓶中，加入1.0mL氨水（25％）用水溶解定容至刻度。

5、2.35 g／L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵（NH4VO3）于100mL棕色容量瓶中，加入2mL硝酸溶液（3），用水溶解定容至刻度。

避光条件下保存一周有效。

6、颜色终止液：移取2份硝酸溶液（3），1份钼酸铵溶液（4），1份钒酸铵溶液（5）混合后使用，现用现配。

7、磷酸二氢钾（KH2PO4）：基准物。

8、显色液配制：（6）：（水）：（4）：（5）=1：2：1：19、仪器和设备：恒温水浴锅、分光光度计、酸度计、离心机掌握要点植酸酶酶活的测定的方法实验内容1、标准曲线的制作（1）按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液。

标准序号标准磷液／mL 蒸馏水／mL 相当于无机磷／ug 显色液/mLOD660nm1 0 3.0 0 32 0.2 2.8 2 33 0.4 2.6 4 34 0.6 2.4 6 35 0.8 2.2 8 36 1.0 2.0 10 3（2）显色反应：将上表中反应液立即摇匀，37℃水浴保温20分钟，冷却至660nm测OD 值，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y＝ax+b）。

2、样品中植酸酶活力的测定（1）酶液的制备取实验五中的摇瓶培养液为试样，在离心机上以3000r／min离心15min，根据情况分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液（1）稀释，待反应。

（2）酶活的测定取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，以空白实验作为参照液，测定样品在660nm 的OD值。

酶活＝30C F ⨯＝30V n F ⨯＝VM m F ⨯⨯30 ＝VmF ⨯⨯⨯3130（U ／L 或U ／mL ）式中：F ——试样溶液反应前的总稀释倍数。

m ——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的质量，μg ； 30——反应时间，min ；31——磷的摩尔质量，g/mol ；V ——实际取酶液样品的体积，mL 。

结果表示：三次平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。

实验六（一） 红曲米固态法生产 (2学时) 目的要求1、了解红曲米的作用和用途。

2、掌握固态发酵法生产红曲米的方法和原理。

方法原理红曲米是由红曲菌（Monascus Pupureus Went ）接种在米饭上繁殖，经干燥后所得的一种紫红色干米粒。

它又称红曲、丹曲、赤曲等。

在我国，红曲米发明已有一千多年历史，李时珍在《本草纲目》中称其为佳品。

红曲米广泛用于食品着色、食品发酵和中医药中。