天然产物化学：薄层色谱法的谱操作及显色剂的选择
薄层色谱的原理
薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。
薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。
一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。
操作步骤
1．薄层板的制备
可以购买商品的预制板，也可以自行制备。
制备方法是：将玻璃板裁成正方形或长方形，分析用为20cm×20cm和10cm×20cm；预试用为3cm×10cm和2.6cm×7.6cm(显微镜用载玻片)。
将玻璃片洗净烘干。
铺层方法有干法和湿法两种，现常用湿法，因为它具有薄层牢固、可批量制备、展开后便于保存、分离效果好等优点。
市售的薄层用硅胶标有硅胶GF254和硅胶GF365，加有1.5%～2％荧光剂的荧光薄层板，用于在紫外光254nm或365nm 照射定位用。
在紫外光照射下，薄层板显荧光，样品斑点处不显荧光。
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2．点样
样品制成溶液(溶剂最好选择与展开剂极性相似且易于挥发的有机溶剂)，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2—4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。
点样量与薄层性能、厚度及显色灵敏度有关，根据需要来具体确定。
点样量太小，斑点不能显示，点样量太大，影响比移值和斑点形状。
3．展开
首先是选择展开剂，合适的分离体系是分离成功的关键，选择原则与经典柱色谱相同。
合适的展开剂使组分展开后斑点清晰、集中、不拖尾，待测组分的Rf值最好为0.4～0.5。
如待测组分较多，Rf值也可在0.25～0.75。
展开的实验操作是将点样后的薄层板置于密闭的层析槽中，下端浸入展开剂高度不超过0.5cm（切勿将样点浸入展开剂中）。
展开距离一般为10-15cm。
4．定位与显色
确定被分离组分的位置称为定位。
通常用比移值Rf表示组分移动的特性，其定义为：Rf=原点至组分斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离。
展开后的薄层板自槽中取出，室温下挥发去溶剂。
若被分离组分
本身有颜色，它们的位置根据有色的斑点即可确定。
无色的化合物可采用物理检出法、化学检出法来定位。
(1)物理检出法物理检出法属于非破坏性检出法。
常用的有：
①紫外光有的化合物能吸收紫外光同时发出更长波长的光即荧光，可用此荧光定位。
另一种方法是荧光消退技术，用有荧光剂的薄层板进行展开，于254nm或365nm荧光灯下观察，在波长230～390nm有吸收的化合物，在绿色的荧光背景上显暗紫色斑点。
如化合物的紫外吸收较弱则检出不灵敏。
②碘多数有机化合物能吸附碘，使斑点呈淡黄色或褐色。
此反应一般可逆，碘挥发后，组分又回到原来的状态。
此法可在密闭容器中放几粒碘晶体或喷雾0.5％碘的三氯甲烷溶液。
③憎水化合物在硅胶薄层展开后，可用水喷雾，对光观察，显示白色不透明的斑点。
(2)化学检出法：化学检出法是使用一种或数种显色剂与被检出化合物反应，生成有色化合物而定位。
5．定性
①与已知的标准品在同一块薄层板上进行对照，若Rf值相同，可能为同一化合物。
还需用几个薄层层析系统比较，组分与标准品的Rf值均一致，一般可认为是同一化合物。
②试样斑点与标准品的显色特性相同可帮助鉴定。
③斑点用光密度计原位扫描，得到吸收光谱或荧光光谱可用于定性。
④收集斑点，洗脱组分，用紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振等方法鉴定。
6．定量
样品组分经薄层分离后，可用以下两种方法定量：
①洗脱法把组分斑点位置的吸附剂取出，用溶剂洗脱后，用其它方法(如分光光度法、荧光等方法)测定。
此法操作复杂，效率较低。
②原位法即在薄层上组分斑点位置进行测定。
又可分为目测法、测面积法和薄层扫描仪扫描定量法。
常用显色剂种类
显色剂可以分成两大类：一类是检查一般有机化合物的通用显色剂；另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。
l．通用显色剂
①硫酸常用的有四种溶液：硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5mol／L硫酸溶液与0.5-1.5mol／L硫酸铵溶液，喷后110℃烤15min，不同有机化合物显不同颜色。
②0.5％碘的氯仿溶液对很多化合物显黄棕色。
③中性0.05％高锰酸钾溶液易还原性化合物在淡红背景上显黄色。
④碱性高锰酸钾试剂还原性化合物在淡红色背景上显黄色。
1％高锰酸钾溶和5％碳酸钠溶液等量混合应用。
⑤酸性高锰酸钾试剂喷1.6％高锰酸钾浓硫酸溶液(溶解时注意防止爆炸)，喷后薄层于180℃加热15～20min。
⑥酸性重铬酸钾试剂喷5％重铬酸钾浓硫酸溶液，150℃烤薄层显色。
⑦5％磷钼酸乙醇溶液喷后120℃烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。
⑧1％铁氰化钾溶液和2％三氯化铁溶液等量混合使还原性物质显蓝色，再喷2mol／L盐酸溶液，则蓝色加深。