第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作原理 第三章 基因疫苗抗原基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构建 第五章 基因疫苗制备第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素第九章 基因疫苗安全性第十章 细菌病基因疫苗第十一章 病毒病基因疫苗第十二章 寄生虫病基因疫苗第十三章 肿瘤基因疫苗第十四章 控制动物生长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
其中，质粒是目前应用最为广泛的克隆载体。
下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。
（一）质粒特性质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。
有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。
有的质粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。
质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。
例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。
质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。
质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。
根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类型。
严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。
质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA（ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。
质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。
实验室常利用这些理化特性鉴定和纯化质粒。
质粒具有以下几项生物学特性：• 寄生性：质粒可以在特定的宿主细胞内存在和复制。
• 稳定性：每种质粒在特定的宿主细胞内保持着一定的拷贝数。
• 重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。
• 不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中，其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。
• 传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。
• 消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。
• 复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。
• 表现型：不同的质粒有不同的表现型，例如对抗生素的抗性等。
（二）质粒载体必需具备的条件1 、拷贝数较高质粒拷贝数是指宿主细菌（胞）在标准培养基条件下，每个细菌（胞）中含有的质粒数目。
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，将质粒分为严紧型和松弛型两种。
每个宿主细胞中含有1-3 个拷贝拷数的质粒称为“严紧型”质粒（ Stringent plasmid ）。
有的质粒拷贝数较高，每个宿主细胞中可达 10-60 个拷贝，称为“松弛型”质粒（ Relaxed plasmid ）。
高拷贝质粒倾向在松弛控制下进行复制，而低拷贝的质粒则通常是在严紧控制下复制。
高拷贝质粒复制的启动是由质粒编码基因合成的功能蛋白质调节的，与宿主细胞周期开始时合成的不稳定的复制起始蛋白质无关。
如果用氯霉素或者壮观霉素等蛋白质合成抑制剂处理宿主细胞，宿主细胞染色体 DNA 复制受阻，但是松弛型质粒仍然可以继续扩增。
有时实验室为了提高质粒的产量，常用氯霉素或者壮观霉素等处理就是这个原理。
低拷贝质粒的情况则不同，它的复制受宿主细胞不稳定的复制起始蛋白质控制，并能与宿主细胞染色体同步复制。
2 、分子量较小一般来说低分子的质粒通常拷贝数比较高，这不仅有利于质粒 DNA 的制备，同时还会使细胞中克隆基因的数量增加。
分子量小的质粒对外源 DNA 容量较大，容易分离纯化，容易转化。
当质粒大于 15 kb 时，转化效率会低一些。
3 、具有选择标记抗性是常用的选择标记，例如氨苄青霉素抗性（ Amp r ）、卡那霉素抗性（ Kan r ）、四环素抗性（ Tet r ）等。
如果抗性基因内有若干单一的限制酶切点就更好。
当基因克隆成功时，由于外源基因插入使该抗性基因失活，这时宿主菌变为对该抗菌素敏感的菌株，这样容易检测。
β- 半乳糖苷酶筛选系统也是一个常用的方便的筛选系统。
质粒上带有一个来自大肠杆菌的 lac 操纵子，编码 β- 半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。
异丙基 -β-D 硫代半乳糖苷（ IPTG ）可以诱导该蛋白片段的合成，这个片段能与宿主细胞所编码的 β- 半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段进行 α 互补。
在培养基中有 IPTG 诱导物时，细菌含有编码 lacZ 基因的质粒，同时合成该酶的两种片段。
该菌将在有生色底物 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲噌 -β-D- 半乳糖苷（ X-gal ）的培养基上生长，形成蓝色菌落。
将一连串克隆位点克隆到 β- 半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源基因插入质粒的多克隆位点后可使 β- 半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏 α 互补作用。
因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。
利用这种筛选方法可以方便地将含有目的基因的重组子筛选出来。
4 、具有较多的限制性酶切位点目前，常用克隆质粒载体上有多克隆位点（ MCS ），较多的单一限制酶酶切位点对外源基因插入的插入提供了极大的方便。
基因检测免费体验普及基因检测，免费检测大赠送！ 优基因免费基因检测5 、具有复制起始点复制起始点是质粒扩增必不可少的条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件，可使繁殖后的宿主细胞维持一定数量的质粒拷贝数。
质粒在一般情况下含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。
但穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核复制子，另一为真核复制子。
（三）常用的克隆质粒第一个成功地用于克隆真核基因的大肠杆菌质粒是 pSCl01 质粒。
pBR322 是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，得到广泛的应用。
下面介绍目前常用的克隆质粒载体 pUC 系列和 pGEM 系列。
1 、 pUC 质粒pUC 系列质粒载体，包括如下 4 个组成部分：（ 1 ）来自 pBR322 质粒的复制起点（ ori ）；（ 2 ）氨苄青霉素抗性基因（ Amp r ），但它的 DNA 核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶切位点；（ 3 ）大肠杆菌 β- 半乳糖酶基因（ 1acZ ）的启动子及其编码该基因氨基端 α- 肽链的基因序列，称为 lacZ' 基因；（ 4 ）多克隆位点（ MCS ）区段：位于 lacZ' 基因中的靠近 5'- 端，内含十几个限制性内切酶位点，使含有不同粘端的目的 DNA 片段可方便地定向插入载体中。
但它并不破坏 lacZ' 基因的功能。
pUC 质粒系列是目前基因工程研究中较通用的克隆载体之一。
以下以 pUC18 质粒为例介绍其特点。
（ 1 ）具有更小的分子质量和更高的拷贝数在 pBR322 基础上构建 pUC 质粒载体时，仅保留了其中的氨苄青霉素抗性基因及其复制起点，使分子量相应减小。
由于偶然的原因，在操作过程中使 pBR322 质粒的复制起点内部发生了自发的突变，即 rop 基因的缺失。
由于该基因编码的 Rop 蛋白是控制质粒复制的特殊因子，它的缺失使得 pUCl8 质粒的拷贝数比带有 pMB1 或 ColEl 复制起点的质粒载体都要高得多，平均每个细胞可达 500-700 个拷贝。
（ 2 ）重组子的检测方便pUCl8 质粒结构中具有 lacZ' 基因，编码的α- 肽链可参与α- 互补。
因此，在应用 pUC8 质粒为载体的重组实验中，可用 X-gal 显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。
（ 3 ）具有多克隆位点（ MCS ）区段pUCl8 质粒载体具有与 M13mp8 噬菌体载体相同的多克隆位点（ MCS ），可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。
因此，克隆在 MCS 当中的外源 DNA 片段，可以方便地从 pUCl8 质粒载体转移到 M13mp8 载体上，进行克隆序列的核苷酸测定工作。
同时，也正是由于具有 MCS 序列，可以使具两种不同粘性末端的外源基因直接克隆到 pUCl8 质粒载体上。
2 、 pGEM 系列GEM 质粒系列是与 pUC 系列十分类似的小分子载体。
总长度为 2 743 bp ，含有一个氨苄青霉素抗性编码基因和一个 lacZ' 编码基因。
在后者还插入了一段含有 EcoR Ⅰ、 Sac Ⅰ、 Kpn Ⅰ、 Ava Ⅰ、 Sma Ⅰ、 BamH Ⅰ、 Xba Ⅰ、 Sal Ⅰ、 Acc Ⅰ、 Hind Ⅱ、 Pst Ⅰ、 Sph Ⅰ和 Hind Ⅲ等的多克隆位点。
此序列结构几乎与 pUCl 8 克 隆载体的完全一样。
pGEM 系列与 pUC 系列之间的主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即 T7 启动子和 SP6 启动子，它们为 RNA 聚合酶的附着提供特异性识别位点。
由于这两个启动子分别位于 lacZ' 基因中多克隆位点区的两侧，若在反应体系中加入纯化的 T7 或 SP6 RNA 聚合酶，便可以将已经克隆的外源基因在体外转录出相应的 mRNA 。
质粒载体 pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于 SP6 和 T7 这两个启动子的位置互换、方向相反而已。
由于 PCR 产物在多数的情况下 3' 端均有 A 碱基，如果用平整末端载体与其连接效率比较低，用 T- 载体克隆是比较好的办法，其中 pGEM-T 或 pUC-T 比较常用。
它们的基本骨架与相应的载体系列基本相同，只是在线形化的质粒载体平整末端的 5' 端有一个突出的碱基 -T 。
利用这个特点，使载体与 PCR 产物之间产生了小的互补粘端，使 PCR 产物的克隆效率大幅度提高。
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