第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）一、名词解析1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。

2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。

不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。

3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。

不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

4.质粒的转移性：质粒具转移性。

它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。

它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。

5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。

这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。

它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。

6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。

α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。

8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。

9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。

这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA 的整合或插入。

10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶源化。

11.载体:将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。

12.粘粒:粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。

cos序列是 l 噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。

粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。

它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。

13.柯斯质粒:一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建的复合载体。

柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是一种由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

柯斯质粒在结构组成上具有l噬菌体的特性、也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35～40kb的外源基因。

14.pcos1 EMBL载体:pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。

该载体的复制起点来源于 R6K 质粒，与 ColE1 复制起点无同源性，属于不同的不相容群，含卡那霉素和四环素抗性基因。

15.F 因子:大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。

它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。

虽然F 因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。

16.穿梭载体:穿梭载体（Shuttle vector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。

17.整合载体:在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体。

18.酵母人工染色体:酵母人工染色体 YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。

19.端粒重复序列:端粒重复序列定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

20.细菌人工染色体：细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。

21.标签蛋白：用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase, GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、蛋白质 A（protein A）和纤维素结合位点（cellulose binding domain）等。

22.随机突变体库：随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过 DNA 重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。

23.琥珀突变：在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则这种突变称为琥珀突变。

24.克隆载体：用于扩增或保存 DNA 片段的载体称为克隆载体。

25.插入失活：指当外源 DNA 片段插入某一基因后，导致该基因失活。

26.染色体步查：采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA 片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重组克隆。

27.表达载体：该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。

二、填空题1.质粒DNA、病毒DNA、质粒和病毒DNA杂合体2.复制区（含有复制起点）、选择标记（主要是抗性基因）、克隆位点（便于外源DNA的插入）3.同一个不亲和、复制机制相同4.pMB1、pSC101、pSF21245.pBR322 、M13、pMB1、转座子6.DNA连接酶7.溶源性8.β-半乳糖苷酶9.感染复数和营养状态10.attP attB11.ga1 基因 bio 基因12.感染复数和细胞的营养状态13.插入型载体、置换型载体14.质粒复制起点（colE1）,抗性标记（ampr）,cos 位点15.质粒,A噬菌体16.R6K ，卡那霉素四环素17.着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)、来自四膜虫的端粒(Tel)18.红色菌落，白色菌落19.不稳定的20.F质粒21.低拷贝性22.定点整合23.自主复制序列，端粒24.融合蛋白25.PYAC426.大片段DNA文库27.EcoRⅠ，SmaⅠ28.缺失，基因重排，嵌合体29.游离状态，整合状态30.重组子，空载体31.克隆载体32.谷胱甘肽转移酶基因, 凝血蛋白酶33.融合蛋白、非融合蛋白34.复制子35.选择标记、筛选标记36.氨苄青霉素、四环素37.强启动子38.多功能载体39.不相容性40.严谨型、松驰型41.外源基因、增加、表达元件42.溶源状态、裂解循环43.cos 序列、质粒、λ噬菌体44.强启动子45.裂解循环、溶源状态46.cos 序列三、选择题1. A2. B3. D4. B5. E6. A7. B8. B9. D10.D11.B12.C13.BCD14.ABCD15.ABC16.ABCD17.C18.B19.B20.A21.B22.C23.A24.D25.B26.C27.B28.A29.C30.B31.C32.B33.B34.C四、判断题1.错误质粒也有线性的2.正确3.错误 ColE1上没有四环素抗性基因，不能通过抗性筛选4.错误对于那些有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体5.正确6.错误 Int 是Ⅱ型拓扑异构酶7.错误噬菌体 DNA 通过θ方式进行复制8.错误最大 11kb9.正确10.正确11.正确12.正确13.错误外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑14.正确15.错误 F菌毛不是供体与受体细胞之间产生性接触所必需16.YAC 人工染色体载体具真核 mRNA 的加工活性17.YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒。

18.与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。

带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。

19.F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在。

20.BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。

21.在P1 噬菌体载体系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb。

22.P1 人工染色体结合了 P1 载体和 BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。

23.表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。

24.错误选择标记用于鉴别目标DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。

25.错误lacZ 基因是乳糖lac 操纵子中编码β-半乳糖苷酶的基因。

26.正确27.正确28.错误氨苄青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。

29.正确30.正确31.错误对野生型大肠杆菌来说，感染复数越高，营养状态越差，溶源化（lysogenization）的频率就越高。

32.错误重组λ噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。

33.错误λ噬菌体载体克隆外源DNA 片段的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是在形式上有许多差别。

34.错误λ噬菌体是一种温和噬菌体，感染宿主后或裂解生长或以溶原状态存在。

五、简答题1.简述烈性噬菌体的溶菌生长周期的基本过程？答：1）吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接收器上。

2）注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。

3）转变：被感染的细菌细胞的功能发生变化，成为制造噬菌体的场所。

4）合成：功能发生了转变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。

5）组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体的颗粒，这个过程也叫噬菌体的形态建成。

6）释放：新合成的自带噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。

2.简述lacZ基因功能选择法？答：根据lacZ基因编码产物β-半乳糖苷酶在Xgal-IPTG培养基平板上显色反应的原理，已经在某些插入型的l噬菌体载体的lacZ基因中，引入了若干常用的核酸内切限制酶识别位点。