分子克隆载体（vector）载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。

载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。

载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。

载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。

重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。

它们的受体细胞都是大肠杆菌。

这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。

因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。

根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。

质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。

载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。

1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。

将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。

常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。

对载体的要求一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。

②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。

③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Amp r）和四环素抗性基因（Tet r）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。

④分子量相对较小和较高的拷贝数。

此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。

主要是对目的基因克隆,建立DNA文库和cDNA文库,其上有复制子即可。

2.表达载体(expression vector):就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS 位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（注释RBS：核糖体结合位点（ribosome-binding site）即核蛋白体结合位点是细胞mRNA的一段序列，它包括蛋白质合成起始期被30S亚基结合的一个起始密码子。

翻译起始作用发生在称为核糖体结合位点的mRNA的特定序列上。

这是位于编码区前面的一段很短的碱基序列。

外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。

大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。

mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）3.穿梭载体(shuttle vector):是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。

例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.一、质粒质粒（plasmid）是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子，它是闭合环状的双链DNA 分子，大小从1kb直到200kb以上。

质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。

例如基因的产物是某些抗生素或对某些抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产生限制酶或修饰酶等。

质粒DNA分子具有三种构型:Closed circle DNA,ccDNA;supercoil;SC构型；Open circle DNA,OC构型；Liner DNA,IDNA;L构型。

在天然条件下，许多种质粒是通过类似于细菌接合的过程传递给新的宿主。

在实验室条件下，质粒则可通过转化过程进入受体细胞。

（质粒具转移性。

它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。

它需要移动基因mob，转移基因tra，顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic。

）此时，受体细胞已经过处理而处于感受态，即它的细胞暂时易于让小的DNA分子透过。

受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。

如对某种抗生素的抗性，这样就可用这种抗生素作为选择条件，选出被质粒转化的受体细胞。

质粒复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。

有些质粒处于“严紧控制”之下，即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。

因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。

这称为“严紧型”质粒。

另一些质粒则是处于“松弛控制”之下的“松弛型”质粒。

每个细菌中可以有10～200份拷贝。

更重要的是松弛型质粒的拷贝数，可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份。

宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止。

但松弛型质粒仍继续进行复制。

因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的合成。

图1pBR322的基本结构（一）大肠杆菌质粒应用的最广泛的质粒载体是pBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。

它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定，基本结构如图1，当需要用pBR322来克隆BamHI酶切的一个DNA片段时，一般的做法是如图2所示。

图2pBR322克隆DNA片段的程序从图2可见，外源DNA片段同pBR322都经BamHⅠ酶切，所以有相同的单链“粘性末端”，通过DNA连接酶可以构成重组DNA分子。

由于pBR322的BamHⅠ酶切点在四环素的抗性基因中，所以BamHⅠ酶切后使这个抗性基因失活。

如果酶切后的质粒pBR322自身又重新连接，则恢复对四环素的抗性，转化子就仍然具有对二种抗生素的抗性。

如果pBR322中插入外源DNA，则转化子失去了四环素抗性表型，而只有对氨苄青霉素的抗性，这样就可根据转化子的抗性而把重组质粒转化的细菌选出，然后扩增细菌，大量回收质粒DNA，从而达到大量扩增外源DNA的目的。

（二）真核生物中的质粒真核生物中的酵母是国内外广泛研究的载体-受体系统之一。

这是一个共价闭环DNA 分子（cccDNA），平均周长2μm，所以称为2μmDNA质粒，在每个酵母细胞里约有100个拷贝。

已有人把2μmDNA同pBR322DNA构建成双功能质粒，可在大肠杆菌和酵母菌中复制。

这种质粒带有啤酒酵母的二个基因（his3和Leu2），所以很容易用酵母的营养缺陷型菌株来选出。

二、噬菌体和病毒载体噬菌体λ是最主要的一种载体。

自从1974年以来，已用野生型λ改造和构建出一系列噬菌体载体。

噬菌体λ是温和噬菌体。

基因组是长约50kb的双链DNA分子。

在噬菌体λ颗粒中，DNA 是线状双链分子带有单链的互补末端。

末端长12个核苷酸，这称为粘性末端，简写COS。

当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过COS而成环状。

在感染早期，环状DNA分子进行转录。

在此期间，噬菌体有两条复制途径可供选择：一是裂解生长。

环状DNA分子在宿主细胞里复制若干次，合成了大量的噬菌体基因产物，形成子代噬菌体颗粒，成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。

另一是溶源性生长。

噬菌体DNA整合进宿主菌的基因组，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。

λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子,全长48502bp,两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链(粘端),称为cos位点.λ噬菌体有61个基因,其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区,这一区段的缺失,或在此区段中插入外源DNA,并不影响噬菌体的增殖,这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据.（一）噬菌体λ载体的构建野生型噬菌体λDNA全长约50kb，上有65种限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、Nar Ⅰ、NheⅠ、SnaBⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶各有一个切点外，其余都多于2个。

有些酶切点在λ增殖所必需的基因区域内。

因此，噬菌体λ必须经过改造才能用作载体。

现在用的λ载体大都除去了某种限制酶的酶切点。

因此，作为载体的噬菌体λ都短于野生型。

噬菌体λ载体有两种类型：①插入型。

由于改建后的噬菌体λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。

只要插入的位置不影响噬菌体增殖。

而且噬菌体DNA缺失越长，插入片段就可越大。

②置换型。

噬菌体λ的基因组可分为三个区域，左侧区包括使噬菌体DNA 成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb。

右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。

中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。

置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。

噬菌体λ裂解生长的能力同包装在头蛋白中的λDNA的大小有关。

当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。

因此要求λ载体DNA和外源DNA 长度之和在39～53kb之间。

置换型载体DNA用选定的限制酶完全酶切后，要设法除去中间片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段连接，包装成重组噬噬体。

这是因为左臂和右臂与中间片段间都有单链“粘性末端”，在连接酶作用下可以重新恢复原来的结构，从而影响了同外源DNA的连接。