苹果根原生质体分离条件的研究1于立杰，王忆，许雪峰，李天忠，韩振海中国农业大学园艺植物研究所/北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室，北京（100193）E-mail：rschan@摘要：以苹果属珠眉海棠(Malu zumi Mati)根为供体进行原生质体分离条件的研究，结果表明，酶解过程中酶液浓度、酶液渗透压、酶解时间均对原生质体分离效果产生重要影响。
对于珠眉海棠，一步酶解法、两步酶解法皆可以分离根原生质体，但两步酶解法优于一步酶解法。
两步酶解法的最佳分离条件为：Cellulysin28 mg•mL-1+ 纤维素酶(Cellulase RS)15 mg•mL-1 + 果胶酶(PectolaseY-23)2 mg•mL-1。
关键词：珠眉海棠；根系；原生质体；分离中图分类号：S661.11.引言原生质体是指植物细胞中除去细胞壁的裸露部分[1]，质膜上存在许多跨膜蛋白，在离子转运中起着重要作用[2]。
原生质体在研究植物转基因、组织再生、跨膜离子转运中能够作为重要的材料[3]。
利用原生质体进行细胞融合，可以实现远缘遗传重组，创造新的遗传型；转移抗逆性状，改良作物品质；转移细胞质基因控制的性状。
原生质体还可以作为受体进行基因重组与转移，培养优质高产新品质，提高植物细胞中次级代谢物质含量[4,5]。
所有成功的原生质体培养都是采用酶解法分离原生质[6]。
膜片钳技术可以测定质膜离子通道，而在测定过程中原生质体的分离状况对测定起着至关重要的作用[7 ,8]。
目前对苹果根系原生质体分离的研究国内外鲜见报道[9,10]，影响了以原生质体为试验对象的苹果细胞学及新种质创造的进程。
因此，本文以苹果属植物珠眉海棠为试材，对影响其根系原生质体分离效果的诸因素进行研究，旨在确定获取高产优质原生质体的适宜条件，为利用原生质体研究苹果电转化和基因枪细胞中离子跨膜运输和转基因过程中转化等提供材料和技术基础。
2.材料和方法2.1原生质体的分离将珠眉海棠(M.zumi)水培3-6个月的幼苗的白色幼嫩初生根切成0.5-1.0 mm小段，按材料：酶液＝1：10的比例置于酶解液中。
酶解液经0.22 µm混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。
在水浴振荡器中酶解。
酶解结束后，将原生质体连同酶解液经400目尼龙滤网过滤，以除去未酶解完全的细胞团或组织，将滤液转移至离心管中，用1000 r/min离心5 min，弃上清，留沉淀，再加入洗液，充分混匀后，离心5 min。
此过程重复3次，收集原生质体备用。
1本课题得到教育部博士点基金（20050019048）、国家自然科学基金（30671441）和北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室的资助。
2.1.1一步酶解法酶解液为：纤维素酶（Cellulase R-10），果胶酶（Pectolase Y-23），0.45 mol/l山梨醇，2 mmol/LCaCl2，1 mmol/LMgCl2，2 mmol/L葡聚糖硫酸钾。
用Mes-Tris调节pH为5.5。
水浴振荡器中(25±1 ℃，40-60 r/min) 酶解12-16h。
共设20种酶处理浓度组合：Cellulase R-10浓度分别为5、10、15、20 mg•mL-1，Pectolase Y-23浓度分别为1、2、3、4 mg•mL-1。
2.1.2两步酶解法酶基础液：2 mmol/LCaCl2，1 mmol/L MgCl2，0.05 mg•mL-1牛血清白蛋白(BSA)，0.044 mg•mL-1抗坏血酸(VC)，0.5 mg•mL-1 PVP。
酶解液1：在酶基础液中加入28 mg•mL-1 Cellulysin（pH 5.8）。
酶解液2：在酶基础液中加入Cellulase RS，Pectolase Y-23，调节pH为5.8。
两步酶解法应用三种酶处理，采用三因素四水平正交设计法。
表1两步酶解法试验因素水平表Table1 Factors and Levels of the Test for the Two-step Method水平LevelACellulysin/mg·mL-1B果胶酶Pectolase Y-23/mg·mL-1C纤维素酶Cellulase R-10/mg·mL-11 21 152 28 2103 35 3154 42 420先将根段置于酶解液1中，在水浴振荡器中（25±1 ℃，100 r/min）酶解40 min，用100目尼龙滤网过滤，冲洗；而后将根段放入酶解液2（Cellulase RS、Pectolase Y-23(pH5.8)）中酶解100 min。
2.1.3不同渗透浓度和不同处理时间对原生质体分离的影响渗透调节剂采用山梨醇，处理浓度分别为0.35 mol•L-1、0.45 mol•L-1、0.55 mol•L-1、0.65mol•L-1、0.75 mol•L-1。
一步酶解法中处理时间：6、8、10、12、14、16 h两步酶解法中处理时间：第一步酶解进行20、30、40、50 min处理，第二步酶解进行1、1.5、2 h处理。
2.2 原生质体产量和活力的测定2.2.1原生质体产量测定将收集到的原生质体稀释2~5倍后，滴加在血球计数板上，计算原生质体数，每个样品计数6个重复，最后计算出原生质体产量。
2.2.2 原生质体活力的测定活力测定采用FDA染色法，以不染色的原生质体占总观察数的百分率，即存活率来表示。
重复3次。
3．结果与分析3.1 一步酶解法中酶浓度对原生质体分离的影响表2一步酶解法中纤维素酶和果胶酶对苹果根原生质体分离的影响Table2 Effects of cellulase and pectolase on root protoplasts isolation by one-step method纤维素酶Cellulase R-10 /mg·mL-1果胶酶Pectolase Y-23/mg·mL-1原生质体产量Yield/106•g-1 FW原生质体活力Viability/%5 110.2ij13.4jk5 222.1ef18.7ij5 317.5fgh17.9ij5 48.6j9.7k10 114.4ghij26.3gh10 224.5e57.4ab10 326.8de21.3hi10 411.6hij14.5jk15 118.2fg30.6fg15 248.6a62.3a15 342.1b46.7bc15 421.9ef37.6de20 114.5ghij21.8hi20 241.8b35.2ef20 332.5cd42.9cd20 417.7fgh22.6hi 注：不同字母代表有显著性差异P＜0.05表2表明，在试验浓度范围内，同一纤维素酶浓度下，随果胶酶浓度提高，原生质体产量和活力先升高再降低，其中以果胶酶2 mg·mL-1或3 mg·mL-1时产量高；4 mg•mL-1果胶酶的酶解物中存在大量碎片，这可能与高浓度果胶酶对分离的原生质体的毒害及破坏作用有关；而1 mg•mL-1的果胶酶由于浓度低，不足以酶解出足量的原生质体，从而造成产量下降。
同一果胶酶浓度下，随纤维素酶浓度由5 mg•mL-1至20 mg•mL-1，产量和活力明显增加；在15 mg•mL-1纤维素酶与试验的几种果胶酶浓度配合时，产量及活力均达最佳；其中以15mg•mL-1纤维素酶与2 mg•mL-1果胶酶配合时效果最好。
试验中还使用其它的酶进行处理，低浓度半纤维素酶对分离根系原生质体影响不大，浓度高时酶解碎片增多，不易纯化。
5 mg•mL-1的蜗牛酶和1 mg•mL-1的崩溃酶也造成原生质体的伤害，产生大量碎片。
因此采用一步酶解法分离根系原生质体的最佳组合为纤维素酶15 mg•mL-1＋果胶酶2 mg·mL-1。
3.2 两步酶解法中酶浓度对原生质体分离的影响表3两步酶解法正交试验结果Table3 Results of Two-step Method by Orthogonal Test DesignA /mg•mL-1B/mg•mL-1C/mg•mL-1原生质体产量Yield/106•g-1 FW原生质体力Viability/%1 2 2 20.4ef 26.5fgh1 3 3 24.3e 43.8cd1 4 4 13.1gh 33.6ef2 1 2 11.3ghi 21.1hij2 23 52.1a 63.3a2 3 4 17.4fg 52.2b2 4 1 9.2hij 17.5ij3 1 3 32.5cd 47.9bc3 24 41.8b 53.1b3 3 1 5.6ij 15.4j3 4 2 34.4c 31.7efg4 1 4 8.2hij 24.5ghi4 2 1 10.6hi 42.3cd4 3 2 25.9de 38.6de4 4 3 13.4gh 29.3fg 注：不同字母代表有显著性差异P＜0.05从表3可以看出，在试验浓度范围内，同一Cellusysin浓度下，随果胶酶和纤维素酶浓度提高，原生质体产量和活力先升高再降低，其中以果胶酶2 mg•mL-1时产量和活力高，这可能是高浓度果胶酶致使原生质体产生大量碎片，而1 mg•mL-1的果胶酶由于浓度低，不足以酶解出足量的原生质体，从而造成产量下降、活力降低；在同一果胶酶浓度下，随纤维素酶浓度由5 mg•mL-1至20 mg•mL-1，产量和活力表现出明显的增加。
一定的纤维素酶和果胶酶浓度下，28 mg•mL-1 Cellulysin时原生质体产量和活力最高。
由此可见，以28 mg•mL-1Cellulysin +15 mg•mL-1纤维素酶+2 mg•mL-1果胶酶配合时两步分离法分离根质膜的效果最好。
3.3 渗透调节剂对原生质体分离的影响表4结果表明，在较低的渗透条件下(0.35 mol•L-1)，原生质体活力及产量均低；随渗透压升高，原生质体产量及活力均升高，渗透压为0.45 mol•L-1时产量和活力达到最高；以后随渗透压的提高，产量和活力降低，至渗透压升为0.75 mol•L-1时，产量和活力都很低。
表4 渗透压对原生质体分离的影响Table 4 Effect of osmotic pressure on the protoplast isolation山梨醇Sorbitol /mol•L-1原生质体产量Yield106•g-1 FW原生质体活力Viability/%甘露醇Mannitol/mol•L-1原生质体产量Yield/106•g-1FW原生质体活力Viability/%0.35 22.6c 41.7b 0.35 26.3b 39.4b0.45 38.6a 61.3a 0.45 33.7a 55.8a0.55 34.4b 45.9b 0.55 29.1b 32.6c0.65 13.6d 26.2c 0.65 11.3c 20.9d0.75 4.1e 8.3d 0.75 8.6c 7.8e 注：不同字母代表有显著性差异P＜0.05因此，适宜的苹果根原生质体分离的渗透压为0.45 mol•L-1。