纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。
根据形态待征判断其活力：原生质体呈绿色（若来源于叶
片）及圆而鼓者为活原生质体。
荧光染料活体染色法：荧光素染料可自由透过细胞膜，在
细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而 滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原 生质体死活。 不能吸收而无色。
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机械法
外植体捣碎过滤离心
优点：
未经酶处理，细胞受到伤害小； 无需质壁分离，利于生理生化研究.
缺点：
细胞结构会受到一定伤害；完整细胞少
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酶解法
利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体材料， 分离具代谢活性的细胞。
降解中胶层，软化细胞壁
质体发生聚集作用，经稀释后，50％以上原生质体发生融 合作用；
高Ca2+、高pH值及PEG结合诱导法； 其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合 方法。
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3、融合过程
高密度混合2X105个/ml
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potato
用途：优良单细胞株选择、突变体筛选、单细胞 克隆获得等。
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2、看护培养
看护培养(nurse culture)：在活跃生长的愈伤组织
上进行单细胞培养的方法。 1953年，Muir，愈伤组织能促使单细胞持续分裂 和增殖。机理尚未明了。 方法流程：
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烟草原生质体培养
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A-D当归(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生质体培养再生植株
A-E, 培养的欧当归(Levisticum officinale Koch))原生质体分裂再生成植株的过程 2015/11/2 植物基因组工程实验室 F-L, 培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂， I.染色体桥，J. 2n=22，K.L.多倍体.
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植物ession of GFP fusions in tobacco protoplasts
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七、植物细胞培养的应用
研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异的有用工具； 植物次生代谢产物的生产 突变体的选择
一次操作可实现两个以上亲本的融合作用； 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种。
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2. 促融因素
NaNO3诱导：NaNO3 可中和原生质体表面负电荷，促 进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合率低； 高Ca2＋和高pH值诱导； PEG（聚乙二醇）诱导：在高浓度PEG溶液中，原生
在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用， 并可再生细胞壁，形成完整植株。
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1、用途
可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配
子不亲合性；
可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获
得的遗传变异范围极广；
果胶酶


崩溃酶（Driselase)：为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性； 半纤维素酶

Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生 质体的分离;
蜗牛酶：主要用于体细胞原生质体分离。
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3．原生质体分离
分离： 原生质体分离有机械法及酶消化法。 前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。
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4、条件培养
条件培养：单细胞接种于条件培养基中进行培养。
条件培养基：含有植物细胞培养上清液或静止细
胞的培养基。
看护培养+平板培养
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四、细胞悬浮培养
细胞的悬浮培养(cell suspension culture)：是指
漂浮法: 离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细
胞时．可用20％蔗糖离心，原生质体浮于液面．碎片及老 细胞沉降而得以纯化，纯度高，但产量低； 不连续梯度离心法：将原生质粗提液置于不连续浓度梯度 的溶液中，经离心后分离不同比重的原生质体。
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5．原生质体活力测定
平板培养 看护培养 微室培养 条件培养
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1、平板培养
平板培养法(plating culture)：将一定密度单细胞接
种到固体培养基中进行培养的技术。 1960年，Bergman，筛选效率高、筛选量大，操作 简单，便于活体观察 方法流程：
生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至 更短时间便可增加一倍。
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五、原生质体培养
自1970年首次获得烟草原生质体再生植株成功以 来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余 种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再 生等过程。
必须对细胞给予渗透压保护
优点：获得完整细胞多，可获得纯材料。 缺点：酶量要求严格，对细胞损伤大。
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烟草悬浮细胞系建立
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三、单细胞培养
对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增 殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等 器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。 培养方法：
将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液 体培养基中进行培养的方法。 便于细胞交换，细胞状态易保持一致。 适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。
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1、悬浮培养过程
选择择适宜的外植体； 诱导疏松愈伤组织； 选择适宜的培养基；
悬浮培养；
第四章
植物细胞与原生质体培养
一、基本概念
1、植物细胞培养（plant cell culture）：
指在离体条件下对单细胞或小细胞团进行培 养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
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2、原生质体培养：
通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物 细胞，即为原生质体(Protoplast)。 游离的原生质体像正常的 植物细胞那样具有全能性，
愈伤组织培养放置滤片纯化的单细胞接种于滤纸上
培养转接细胞团
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3、微室培养
微室培养(micro-chamber culture)：悬浮单细胞接
种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固
体培养基中的培养方法。
一步法是将材料在21-28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一
次性处理2-24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再 用纤维素酶脱壁而释放原生质体。
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4、原生质体的纯化
沉降法: 原生质体混合物经微孔过滤后，低速（150g）离 心5min, 沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶液反复洗3-4次， 后用培养液洗涤备用；
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常用的酶类
纤维素酶

Onozuka R-10及RS，国内常用的为EA3-867，其中含少量果胶酶。
Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶 较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用； Pectalyase Y—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1 ％，悬浮细胞为0．05％；
原生质体培养通常与细胞融合、转基因配合进行。
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流程
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1、原生质体制备
材料来源：
可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤
组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶
和胚性组织。
预处理
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期、对数生长期、减慢期及静止 期等阶段。接种时细胞要达到一 定细胞浓度，通常为0. 25 x l06
细胞／ml -0. 5 x 106细胞／
m1。
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连续培养(Continuous culture)：是用一定容积的 非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中 不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充， 细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养
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2. 制备原生质体的酶类
作用：消化细胞壁 高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、
果胶质及蛋白质。
细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同， 木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择材料和消 化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。
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