双向电泳 取 300 l样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线 性加入, 将 17 cm IPG胶条胶面朝下置于槽中, 静置 45分钟后覆盖矿物油, 在 20 溶胀 11- 16 小时。 溶胀后的 胶 条置 于等 电聚 焦盘 中, 在 P rotean IEF Ce ll中进行等 电聚焦, 温 度设置为 20 , 电压模式 设置为: 快速升压, 250 V, 0. 5 小时; 500 V, 0. 5小 时; 10 000 V, 60 000 Vh( 伏特 小时 ) 。取 IEF 后的
单向定量电泳 取蛋白质分子量标准物, 第一次按 1 2稀释后, 以后 按 1 3倍比例逐级稀释, 经 4级稀释后, 取 15 l上 样液上样, 半乳糖苷酶上样量依次分别为 1 g、 0. 24 g、0. 062 g、0. 0156 g、0. 004 g。作 12 g /L SDS 聚丙烯酰胺凝胶单向电泳, 同时电泳 4份胶, 显 色以确定染色灵敏度。
基金项目: 国家自然科学 基金 课题 ( 编号 30200296 ) 及 国家 科技部 863课题 ( 编号 2002AA 230011 ) 基金资助 通讯作者: 秦慧, 主治医师, 在读博士; 电话 ( 028) 85422364. E ma i:l qinhu i6957@ s ina100. com 2005- 02- 07 收稿; 2005 - 11- 29 接受
br illiant b lue, the co llo idal Co om a ssie brillian t b lue, the m o dified C oom assie br illiant blue and the silv er stain ing pro to co ls. T he pro tein detectio n sensitiv ity, com patibility w ith m ass spectrom etry ( M S ) and fac ility o f the four stain ing
Abstract T he a im o f th is study w as to com pare and ana ly ze pro te in sta in ing in o rder to se lect the op tim a l stain ing
m e thod for pro teom ic research. P ro te ins from acute prom ye locy tic leukem ia ce ll line N B4 and pro te in m o lecula r w e igh t m arke r w ere separated re spective ly by 2 D o r 1 D e lectropho re sis and de tected re spectiv e ly by the ty pical C oom a ssie
显色 取出 SDS 聚丙烯酰胺 凝胶, 经超纯水清洗 2次, 每 次 1分钟, 4块胶分别按 4种不同的染色方法显色。 下列每步操作皆在摇床上进行。 4种染色法成份组 成及操作如下: ①传统考马斯亮蓝染色法: 清洗后 的凝胶经固定液 ( 45. 4% 甲醇、4. 6% 乙酸 ) 固定 1 小时, 随后用染色液 ( 45. 4% 甲醇、4. 6% 乙酸、0. 1% CBB G250)着色过夜, 再经洗脱液 ( 5% 甲醇、7. 5% 乙酸 ) 过夜脱色至背景清晰。②胶体考马斯亮蓝染 色法 ( collo idal C oom assie brilliant blue, cCBB ) 染色 法 [ 5] : 凝胶先经超纯水漂洗后, 再用 collo idal Coom assie blue G250 染 色液 ( 1. 6% 磷 酸、8% 硫 酸 铵、 0 02% CBB G250、20% 乙醇 ) 着色过夜, 洗 脱液为 超纯水, 换液 3- 4次直至背景清晰。③改良考马斯 亮 蓝 染 色 法 ( m odified Coom assie br illiant b lue, mCBB) 染色法 [ 6] ; 操作方法同胶体考马斯亮蓝染色 法, 只是染 色液组成不同 ( 0. 12% CBB G250、10% 硫酸铵、10% 磷酸、20% 乙醇 ), 着色 1小时即可。④ 银染 ( silver staining ) [ 2 ] : 凝胶 漂 洗 后 先被 固 定 液 ( 50% 甲醇 + 5% 乙酸 ) 固定 1小时, 随后分别用 50% 甲 醇 和 超 纯 水 清 洗 各 10 分 钟, 0. 02 m g /L N a2 S2 O3致敏 1分钟, 超纯水清洗 2次, 每次 1分钟, 再用预冷的 0 15% A gNO3 着色 20 分钟, 超纯水再 次清洗 2次, 每次 1 分钟, 2% N a2 CO 3 + 0. 04% 甲 醛显色 20 - 30秒, 当溶液变黄以后除去, 换新鲜的 溶液后继续显色直至显色适度后, 以 5% 乙酸终止 显色。
几种双向凝胶电泳蛋 白质检测方法的比较
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法及银染进行了比较, 并就其染色影响因素作出分 析。
材料和方法
试剂 固相 pH 梯度干胶条 ( IPG strip pH 3 10NL, IPG strip pH 5 8, 17cm ) 、urea、CHAPS、TBP、DTT、B io L yte 3/ 10 Am pho ly te、IAM、SDS、T ris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯 酰胺、甘氨酸、CBB G250 均为 B IO RAD 公司产品。 硫酸铵及磷 酸均购自成都 科龙试剂厂。 A gNO3 为 S igm a 公 司 出 品。 P rote in m o lecular w eight m arker # SW 0431为 M B I 公 司 出 品。 甲 醛、N a2 S2 O3 与 N a2 CO 3 分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北 碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。
灵敏性、质谱兼容性、操作的简便 性等角度, 比较了传统考马斯亮蓝染色法、胶体考马 斯亮蓝染色 法、改 良考马斯亮
蓝染色法和银染法 4种蛋白质着色法对凝 胶分离蛋白质 的检测影 响, 探讨了 影响蛋白 质染色 与鉴定 的影响 因素。
结果显示, 银染检测灵敏度最高, 但质谱鉴定相容性差, 鉴定率近 10% ; 改良考马斯亮蓝染色法检测灵敏度也 高, 可
秦慧, 刘霆, 柳斌, 宋鑫, 黄欣, 杨金亮, 赵霞, 魏于全
四川大学华西医院血液科, 人类疾病生物治疗国家重点实验室, 成都 610041
摘要 本研究对蛋白质染色法 进行比较和分析, 以求获得满足蛋白质组研究 所需的适宜 的蛋白质 检测法。实验
采用 2 D 电泳分离急性早幼粒白血病细胞 株 NB4的全蛋白及 1 D 电泳分离蛋白质分子量标准物, 从蛋 l E lectrophoresis
QIN Hui, LIU T ing, L IU Bin, SONG Xin, HUANG Xin, YANG Jin L iang, ZHAO Xia, WEI Yue Quan
D epartm en t of H em atology, S ta te K ey Laboratory of B iotherapy for Hum an D iseases, W est Ch ina Ho sp ita l, Sichu an U n ivers ity, C hengdu 610041, C hina
IPG 胶条, 先后分别置于含 DTT 平衡液 1 ( 6 m o l/L urea, 2 g /L SDS, 0. 05 m o l/L T ris pH 8. 8, 200 m l/L gy lceco,l 2 g /L ) 及含碘乙酰胺平衡液 2 ( 同平衡液 1, 但其中 DTT 换为 2. 5 g /L 碘乙酰胺 ) 中轻微摇荡 各 10分钟。将平衡好的 IPG 胶条置于预先灌制的 12 g /L SDS 聚丙烯酰胺凝胶上, 封固, 在 15 低温 水循环条件下, 15 mA / gel电泳 15 分钟, 然后以 25 mA / gel恒流电泳。
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中国实验血液学杂志 Jou rna l o f Exper im enta l H em a to lo gy 2006; 14( 1): 168- 172
文章编号 ( A rticle ID ): 1009 2137( 2006) 01- 0168- 05
论著
几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较
达 4 ng / spo t, 质谱鉴定率可接近 55% 。结论: 改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质检测灵敏度高, 与质谱兼容好, 能满
足蛋白质组研究需要。
关键词 蛋白质组; 双向凝胶电泳; 蛋白质检测; 考马斯亮蓝染色法; 银染
中图分类号
Q 503
文献标识码 A
C om parison betw een P rotein D etection M ethods for Two
常规方法使用; 而同位素显色则存在安全性和操作 局限性等问题 [ 1- 4] 。因此, 筛选简便、节约、检测灵 敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究 所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用, 近年来 就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们 作了许多改进, 方法众多, 评价不一 [ 5- 7] 。我们在 作双向凝胶电泳时, 将常用的几种考马斯亮蓝染色
silver sta ining
J Exp H ematol 2006; 14( 1): 168- 172
蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及 准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的 着色不仅影响蛋白质分离的分辨率, 同时也影响后 续的质谱鉴定。选择适当的蛋白质染色法将有助于 提高蛋白质组学研究结果的质量。蛋白质的染色常 用的有 4类: 有机试剂染色、银染、荧光染色及同位 素显色。其中有机试 剂染色以考马 斯亮蓝染色法 ( Coom asie brilliant b lue, CBB ) 为代表, 在蛋白质分 析中常用, 但对低丰度蛋白质的显现较差; 银染灵敏 度虽高, 却常与质谱不兼容; 荧光染色以 SYPRO 试 剂为主, 蛋白质检测灵敏度高, 能兼容质谱, 但由于 需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵, 未被作为