生物技术大实验第一部分植物组织培养实验一、母液的配制和保存（3学时）一、实验目的通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。

二、原理配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。

使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。

以MS培养基为例，所需配制的母液为：大量元素母液（母液Ⅰ，浓缩10倍）、微量元素母液（母液Ⅱ，浓缩100倍）、铁盐母液（母液Ⅲ，浓缩100倍）和有机化合物母液（母液Ⅳ，浓缩100倍）等。

三、实验仪器设备和试剂冰箱，天平，酸度计，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(100ml，500ml，1000ml)，药勺、称量纸、滴管、玻璃棒，电炉，微波炉NH4NO3, MnSO4.4H2O, KNO3, ZnSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, Na2MoO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KH2PO4, CoCl2.6H2O, H2BO3，Na2•EDTA•2H2O，KI, FeSO4.7H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇, 蒸馏水四、实验方法1、MS大量元素母液的配制配制时先用量筒量取蒸馏水大约350ml，放入500ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,MgSO4.7H2O ,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入500ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

2、MS微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4•4H2O，ZnSO4•7H2O ，H2BO3，KI ，NaMoO4•2H2O，CuSO4•5H2O，CoCl2•6H2O，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容，装入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

3、MS铁盐母液配制把FeSO4•7H2O和Na2•EDTA•2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解。

保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2•EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后把pH值调到5.5，加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。

在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。

4、MS有机化合物母液的配制按配方表中用量依次称取：肌醇，维生素B1，烟酸，甘氨酸，维生素B6，用蒸馏水依次溶解并定容后，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

5、植物生长物质母液的配制NAA母液：配制浓度为0.1mg/ml。

NAA属于生长素类激素。

6-BA母液：配制浓度为0.1mg/ml。

6-BA属于细胞分裂素。

五、实验报告1、撰写实验报告。

（包括实验名称、目的、原理、实验用品、实验操作内容，实验结果，数据记录与处理、分析和讨论）2、思考题（必做）⑴MS培养基母液配方及其母液的配制⑵植物生长物质母液的配制：实验二、培养基的配制与灭菌（3学时）一、实验目的学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。

二、原理组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。

三、实验仪器设备和试剂天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，酸度计或pH试纸，培养瓶（400个），瓶盖（或封口膜+耐热橡皮筋），线绳，高压灭菌锅，滴瓶琼脂，蔗糖，蒸馏水，1mol/LHCl，1mol/LNaOH四、实验步骤1、培养基的配制培养基A：MS+0.2mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+ 3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8。

（见实验三）培养基B：MS+0.1mg/L NAA+1.5mg/L6-BA+ 3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8。

（见实验四）培养基C：1/2MS+0.1mg/L NAA+1.5%蔗糖+1.0%琼脂，pH5.8。

（见实验四）①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。

②取③按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到搪瓷缸中，在电磁炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至500ml。

④充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.8。

⑤趁热把培养基分装到广口瓶中，每瓶约20~40ml。

封好瓶口。

贴上标签，注明培养基名称，配制者组号（或姓名）和配制日期，待灭菌。

2、培养基灭菌灭菌温度及灭菌时间：121℃（1.06kg/cm2）下灭菌15分钟。

（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121℃（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟）①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。

把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

④刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。

放置在水平桌面上自然冷却。

在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。

经检查没有杂菌生长的方可使用。

五、实验报告撰写实验报告。

（包括实验名称、目的、原理、实验用品、实验操作内容，实验结果，数据记录与处理、分析和讨论）附：稀酸和稀碱的配制方法1mol/LHCl取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。

1mol/LNaOH称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。

实验三、无菌操作及植物的初代培养（6学时）一、实验目的培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个很重要的环节。

通过本实验的操作，领会无菌培养对试验材料消毒、接种的要求，初步掌握植物材料消毒、接种的无菌操作技术。

二、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组织，甚至是细胞的过程。

如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。

外植体在合适的培养基上，通过脱分化，即有可能表现植物细胞的全能性。

三、材料、试剂和器具材料：非洲菊花托、康乃馨茎段及营养芽培养基：MS+0.2mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+ 3%蔗糖+0.8%琼脂器具：（以各组所需为例）无菌器材：3个不锈钢托碟（或培养皿）+吸水纸；1升无菌水；大号、中号镊子各2把；2把解剖刀；2个500ml烧杯非无菌材料：0.1%的升汞水2L；1000ml搪瓷缸或玻璃烧杯(装废液用)；1个500ml消毒缸2盏酒精灯及火机1个；橡皮筋若干，标签纸、记号笔、1把大号镊子四、实验步骤1．接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯。

打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。

（此步由专人统一负责）2. 接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。

先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净，吸干水份后切成大约70mm长的片段放进500ml烧杯中，用蒸馏水冲洗2次，倒掉蒸馏水后倒入0.1%的升汞水消毒，将材料淹没浸泡约10分钟（期间用镊子搅拌几次）。

3. 把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。

用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中，用无菌水清洗3次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒液。

最后一次清洗后转移到无菌托碟上，将接种材料切成一定大小（花托0.5cm2、茎段0.5-1cm）。

4. 取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口。

用镊子将外植体轻轻插入到琼脂上，立即盖上盖子。

5. 操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中。

每组的下一个同学所用操作器械需要在每次使用前消毒一次。

方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。

6. 将培养瓶放到培养箱里，在25℃下培养4～6周，获得充分生长的愈伤组织、不定芽。

五、实验报告（1）接种2天后观察污染情况，计算污染率。

污染率=污染的材料数/总接种材料数×100%2.每周观察并记录外植体产生愈伤组织、不定芽的情况，包括培养物形态的变化，愈伤组织和不定芽出现的时间、量，计算愈伤组织和不定芽诱导率。

实验四、植物的增殖及生根培养（6学时）一、目的通过实验，掌握运用植物生长调节物质调控植物器官分化的方法。

并进一步熟悉无菌操作方法。

二、原理以植物的茎、叶等部分作为外植体进行离体培养，可以直接诱导器官分化，产生芽、根，形成新的植物体；也可以诱导其改变原来的分化状态脱分化形成愈伤组织，“再分化”出根和芽等器官。

在该过程中，植物生长调节物质起着决定作用，调控着培养细胞再生的不同方式。

三、实验材料、试剂和器具1．实验材料：菊花试管苗2．试剂MS母液，各种植物生长物质3．仪器设备无菌器材：生根培养基3～4瓶4～6周龄菊花试管苗3个不锈钢托碟+吸水纸大号、中号镊子各2把2把解剖刀非无菌材料：1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml2盏酒精灯及火机1个橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套1把大号镊子四、实验步骤1、培养基准备：增殖培养基：MS+0.1mg/L NAA+1.5mg/L6-BA+ 3%蔗糖+0.8%琼脂生根培养基：1/2MS+NAA0.1mg/L+1.5%糖+1.0%琼脂2、接种室灭菌。

3、接种培养，在超净工作台上进行无菌操作。

将培养瓶转移到接种室，在将瓶放入超净工作台前用75%的酒精棉球擦拭瓶外表面，减少附在瓶外壁上的灰尘与微生物。

4、增殖培养：在超净工作台上将丛生芽分割成单个芽，切去芽基部的愈伤组织和去掉基部黄叶，然后将单个芽转接到新鲜的增殖培养基上，于温度23±2℃，光强2000lx，光周期为12h的环境下培养。