蛋白质溶液的浓缩方法
但值得注意的是,重金属、某些有机酸与无机酸和蛋 白质形成复合盐后,常使蛋白质发生不可逆的沉淀,应用 时必5 选择变性沉淀法
• 原理:利用蛋白质对某些物理或化学因素的敏感性不同, 有选择地使之变性沉淀,以达到分离提纯的目的。
• 方法: (1)利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂; (2)利用生物大分子的热不稳定性,加热破坏某些组分 ,而保存另一些组分; (3)酸碱变性沉淀。很多蛋白质在pH5.0或以下被沉淀, 只有少数蛋白质在中性或碱性条件下形成沉淀,且可以通 过调节pH来去除杂蛋白。
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1.1 盐析法
e.g 硫酸铵盐析法浓缩蛋白质溶液 硫酸铵因其价格便宜、溶解度高且对温度的敏感性低
而被常用于沉淀蛋白质。
操作方法:(1)加入固体硫酸铵,适用于要求饱和度较 高而不增大溶液体积的情况; (2)加入饱和硫酸铵溶液,适用于要求饱和度不高而原 来溶液体积不大的情况; (3)透析平衡法(多用于结晶),先将盐析的样品装于 透析袋中,然后浸入饱和硫酸铵中进行透析,透析袋内硫 酸铵饱和度逐渐提高,达到设定浓度后目的蛋白析出。
优点:该方法简单高效,操作过程中可以保持蛋白质不变 性,吸附剂可回收利用。
缺点:蛋白质可能吸附在透析膜上,导致回收率低。操作 过程需要低温。
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2.2 凝胶吸附法
• 定义:凝胶是一种惰性多孔聚合物,孔径较小的凝胶具有 很强的吸水性,适宜浓缩分子量在10000以上的蛋白质。 常用的凝胶有Sephadex G系列以及Bio-GelP系列凝胶。
吸附法
• 定义:通过吸附剂直接去除溶液中的水分子以达到浓缩蛋 白质溶液的目的。 吸附法是最简单快速的浓缩蛋白质溶液的方法,所需 仪器简单,特别适用于稳定性较差的蛋白质。
• 吸附剂的选择: (1)吸附剂不能与溶液发生化学反应; (2)吸附剂对蛋白质不吸附; (3)吸附剂易于溶液分开。 常用的吸附剂:PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝胶等。 常用的吸附方法:透析袋法和凝胶浓缩法。
(2)选用一种水溶性非离子多聚物,使蛋白质在 同一液相中,由于分子相互排斥而凝聚导致蛋白析出。该 方法操作时先离心除去大悬浮颗粒,调整溶液PH值和温 度至适度,然后加入中性盐和多聚物至一定浓度,冷贮一 段时间,即形成沉淀。
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2. 吸附法
2.1 透析袋吸附法 2.2 凝胶吸附法
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4.1 原理
• 超滤(Ultrafiltration)技术是一种膜滤法,也有错流过 滤(Cross Filtration)之称。其基本原理是在常温下以一 定压力和流量,利用不对称微孔结构和半透膜介质,依靠 膜两侧的压力差作为推动力,以错流方式进行过滤,使溶 剂及小分子物质通过,大分子物质和微粒子如蛋白质、水 溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留,从而达到分离、分级、 纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。
• 常用的浓缩方法: »沉淀法(蛋白质的沉淀性质) »吸附法(吸水剂) »冻干法(真空低温脱水) »超滤法(分子量)
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1. 沉淀法
1.1 盐析法 1.2 低温有机溶剂沉淀法 1.3 等电点沉淀法 1.4 生成盐复合物沉淀法 1.5 选择变性沉淀法 1.6 非离子多聚物沉淀法
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1. 沉淀法
• 两性解离和等电点 – 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质,在一定的pH条 件下,能解离为带电基团从而使蛋白质带电。
• 蛋白质的变性
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 蛋白质溶液的浓缩连接了蛋白质的提取和蛋白质的分离纯 化,是获取高浓度或高活性蛋白质的重要步骤。
• 浓缩目的:提高蛋白质浓度;减少样品体积; 便于进一步纯化。
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2.1 透析袋吸附法
• 具体操作: 将蛋白质溶液加入到透析袋中(无透析袋可以用玻璃
纸代替),结扎好后将PEG、蔗糖等吸附剂撒在透析袋外 ;或者把吸水剂配成30%-40%的溶液,将装有蛋白质溶液 的透析袋放入吸附剂溶液中。吸水剂用过后,可放入温箱 中烘干或自然干燥后重复利用。
• 优缺点:
蛋白质溶液的浓缩方法
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目录
1 蛋白质种类和特性 2 蛋白质浓缩 3 常用浓缩方法 4 小结与展望
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蛋白质的种类
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蛋白质的性质
• 胶体性质 – 蛋白质的分子量在1万-100万之间,直径在1-100nm 之间,属于胶体粒子。蛋白质的水溶液是一种比较稳 定的亲水胶体,这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多 极性基团,如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2 等和水有高度亲和性,当蛋白质与水相遇时,就很容 易在蛋白质颗粒外面形成—层水膜。
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1.3 等电点沉淀法
• 原理:两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低。
• 适用范围:只适用于水化程度不大、在等电点时溶解度很 低的蛋白质,如酪蛋白。对于亲水性很强的蛋白质,在等 电点附近仍然有很大的溶解度,用等电点法沉淀不完全。
等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用,以提高其沉淀能力。
或生理盐水制成悬浮液, 即可恢复原状态。
终产品的 式吸附在产
质量。慢 品上。
速冷冻,
快速冷冻。
避光贮存
二次干燥
蛋白
初级干燥
冻干粉
冷冻
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3.2 操作过程
油面一定不能低于 油镜的中线。严禁 无油或低油位开启 真空泵。
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4. 超滤法
4.1 原理 4.2 超滤装置及类型 4.3 超滤膜的选择 4.4 注意事项
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1.2 低温有机溶剂沉淀法
• 原理: (1)甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂
介电常数降低,增加了相反电荷的吸引力; (2)上述有机溶剂是强亲水试剂,破坏蛋白质胶体
分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
• 有机溶剂的选择: 有机溶剂首选能与水混容的,常用乙醇、甲醇、丙酮
等。大多数蛋白质通过加入等体积的丙酮或四倍体积的乙 醇就可以沉淀下来,但也造成的了蛋白质溶液的稀释,所 以蛋白质溶液的浓度一般要在1mg/ml以上。
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1.2 低温有机溶剂沉淀法
• 影响因素: (1)温度:低温可保持生物大分子活性,同时降低其溶 解度,提高提取效率;
(2)样品浓度和pH: 与盐析法中的作用基本相同; (3)金属离子:一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH 下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物,这种复合物在 水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降,而且不影响蛋白 质的生物活性。
• 实验室常用超滤管和冷冻离心机,实现蛋白质溶液的超滤 浓缩。
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4.2 装置及类型
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4.2 装置及类型
超滤装置
无搅拌式超滤
搅拌式超滤
中空纤维超滤
浓差极化严重,只适于 浓度较稀的少量超滤。
装置较简单,只是在密 闭的容器中施加一定压 力,使小分子和溶剂分 子挤压出膜外。无搅拌 装置
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1.6 非离子多聚物沉淀法
• 背景:非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀 剂,最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒,近 年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。
包括不同分子量的PEG(常用PEG-6000)、NPEO、 葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等。
• 方法:(1)基于不同蛋白质的表面结构不同,分配系数 不同,可选用两种水溶性非离子多聚物组成液/液两相体 系,不等量分配而分离沉淀。
• 原理:高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水 分子,使溶液中自由水分子数减小,从而破坏蛋白质表面 的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。
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1.1 盐析法
• 盐类的选择:价格低; 溶解度好; 溶解过程中产热少; 盐溶液密度与沉淀的密度有明显差别。
一般来说:高价阴离子:PO43- > SO42- > Ac-和NO3-, 单价阳离子:NH4+ > K+和Na+, 高价阴离子的沉淀效果优于单价阳离子。
(4)离子强度:盐浓度太高或太低都对分离有不利影响 ,对蛋白质和多糖而言,盐浓度不超过5%比较合适,使 用的乙醇量不宜超过二倍体积。
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1.2 低温有机溶剂沉淀法
• 优缺点: 优点:(1)分辨力高于盐析法,即蛋白质只在一个比较 窄的有机溶剂浓度下沉淀; (2)沉淀不用脱盐,过滤更为容易。
缺点:容易使蛋白质变性失活,操作要求在低温下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时,必须在0~4℃低温下进行。蛋 白质被丙酮沉淀后,应立即分离,否则蛋白质会变性。
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4.3 超滤膜的选择
超滤膜
相对流速(ml/min/cm2)
• 优缺点: 优点:很多蛋白质的等电点在偏酸性范围内,调节pH时所 需要的无机酸价格低,操作也比较方便。
缺点:对低pH敏感的蛋白应避免使用此法。
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1.4 生成盐复合物沉淀法
蛋白质可生成盐类复合物沉淀,主要方法: (l)与酸性功能团作用的金属复合盐法(如铜盐、银盐 、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等),沉淀可通以H2S使金属 变成硫化物而除去; (2)与碱性功能团作用的有机复合盐法(如苦味酸盐、 苦酮酸盐、丹宁酸盐等),沉淀加入无机酸并用乙酸萃取 ,或用离子交换法除去。 (3)无机复合盐法(如磷钨酸盐、磷钼酸盐等)。
浓度极化较弱,超滤速 度略有提高。
超滤装置位于电磁搅拌 器之上。向容器内施加 压力的同时开动磁力搅 拌器,大分子向滤膜表 面堆积时,被电磁搅拌 器分散到溶液中。
极大地提高了超滤速度。
在一支空心柱内装有许 多中空纤维毛细管,两 端相通,管的内径一般 在0.2mm左右,有效面积 可以达到1平方厘米。