• 超滤（Ultrafiltration）技术是一种膜滤法，也有错流过滤 （Cross Filtration）之称。其基本原理是在常温下以一定压 力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两 侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及 小分子物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性 高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化 、浓缩目的的一种新型膜分离技术。 • 实验室常用超滤管和冷冻离心机，实现蛋白质溶液的超滤 浓缩。
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1.2 低温有机溶剂沉淀法
• 原理： （1）甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂 介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力； （2）上述有机溶剂是强亲水试剂，破坏蛋白质胶体 分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。 • 有机溶剂的选择： 有机溶剂首选能与水混容的，常用乙醇、甲醇、丙酮 等。大多数蛋白质通过加入等体积的丙酮或四倍体积的乙 醇就可以沉淀下来，但也造成的了蛋白质溶液的稀释，所 以蛋白质溶液的浓度一般要在1mg/ml以上。
蛋白质溶液的浓缩方法
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目录
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蛋白质种类和特性
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蛋白质浓缩
常用浓缩方法
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小结与展望
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蛋白质的种类
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蛋白质的性质
• 胶体性质 – 蛋白质的分子量在1万-100万之间，直径在1-100nm之 间，属于胶体粒子。蛋白质的水溶液是一种比较稳定 的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极 性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有 高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白 质颗粒外面形成—层水膜。 • 两性解离和等电点 – 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，在一定的pH条 件下，能解离为带电基团从而使蛋白质带电。 • 蛋白质的变性
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1.5 选择变性沉淀法
• 原理：利用蛋白质对某些物理或化学因素的敏感性不同， 有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。 • 方法： （1）利用表面活性剂（三氯乙酸）或有机溶剂； （2）利用生物大分子的热不稳定性，加热破坏某些组分 ，而保存另一些组分； （3）酸碱变性沉淀。很多蛋白质在pH5.0或以下被沉淀， 只有少数蛋白质在中性或碱性条件下形成沉淀，且可以通 过调节pH来去除杂蛋白。
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1.2 低温有机溶剂沉淀法
• 影响因素： （1）温度：低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶 解度，提高提取效率； （2）样品浓度和pH： 与盐析法中的作用基本相同； （3）金属离子：一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH 下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在 水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白 质的生物活性。 （4）离子强度：盐浓度太高或太低都对分离有不利影响 ，对蛋白质和多糖而言，盐浓度不超过5%比较合适，使 用的乙醇量不宜超过二倍体积。
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1. 沉淀法
1.1 盐析法 1.2 低温有机溶剂沉淀法 1.3 等电点沉淀法 1.4 生成盐复合物沉淀法
1.5 选择变性沉淀法
1.6 非离子多聚物沉淀法
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1. 沉淀法
• 沉淀法浓缩蛋白质溶液，指将蛋白质分子凝聚从溶液中析 出的现象。 • 沉淀法是比较传统的分离纯化蛋白质的方法，目前仍然广 泛使用。一般常用的沉淀浓缩有硫酸铵沉淀法、（低温） 有机溶剂沉淀法、丙酮沉淀法、免疫沉淀法、三氯醋酸沉 淀法、聚乙二醇沉淀法等。
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2.2 凝胶吸附法
• 定义：凝胶是一种惰性多孔聚合物，孔径较小的凝胶具有 很强的吸水性，适宜浓缩分子量在10000以上的蛋白质。 常用的凝胶有Sephadex G系列以及Bio-GelP系列凝胶。 • 具体操作：将干的凝胶加入到蛋白质溶液中吸收水分子和 其他小分子，当凝胶完全膨胀后，用过滤或立信德方法除 去凝胶，即可得到浓缩后的蛋白质溶液。 • 注意事项：溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则 在凝胶表面会产生阳离子交换，影响蛋白质的回收率。
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4.3 超滤膜的选择
超滤膜 相对流速(ml/min/cm2)
0.05 0.24 0.41 0.41 0.45 0.35 0.04 0.11 0.58 0.18 0.58 0.40 0.14 0.27 0.48
性能特点
肽的回收率高 肽的回收率高，流速较快 应用范围广，流速快，吸附低 应用范围广，流速快 精确的截留分子量限 免疫球蛋白的收率高 去除肽和蛋白 微小组分，游离/结合药物研究 样品清洗，HPLC样品制备 微克量蛋白质的高效回收 免疫球蛋白的快速和高效回收 蛋白质梯度分离 稀释液的高效回收 流速快，收率高，吸附低 免疫球蛋白的收率高
一般来说：高价阴离子：PO43- > SO42- > Ac-和NO3-， 单价阳离子：NH4+ > K+和Na+， 高价阴离子的沉淀效果优于单价阳离子。
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1.1 盐析法
e.g 硫酸铵盐析法浓缩蛋白质溶液 硫酸铵因其价格便宜、溶解度高且对温度的敏感性低 而被常用于沉淀蛋白质。 操作方法：（1）加入固体硫酸铵，适用于要求饱和度较 高而不增大溶液体积的情况； （2）加入饱和硫酸铵溶液，适用于要求饱和度不高而原 来溶液体积不大的情况； （3）透析平衡法（多用于结晶），先将盐析的样品装于 透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫 酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后目的蛋白析出。
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2. 吸附法
2.1 透析袋吸附法 2.2 凝胶吸附法
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吸附法
• 定义：通过吸附剂直接去除溶液中的水分子以达到浓缩蛋 白质溶液的目的。 吸附法是最简单快速的浓缩蛋白质溶液的方法，所需 仪器简单，特别适用于稳定性较差的蛋白质。
• 吸附剂的选择： （1）吸附剂不能与溶液发生化学反应； （2）吸附剂对蛋白质不吸附； （3）吸附剂易于溶液分开。 常用的吸附剂：PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝胶等。 常用的吸附方法：透析袋法和凝胶浓缩法。
中空纤维超滤
极大地提高了超滤速度。 在一支空心柱内装有许 多中空纤维毛细管，两 端相通，管的内径一般 在0.2mm左右，有效面积 可以达到1平方厘米。
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4.3 超滤膜的选择
• 超滤技术的关键是膜。 • 常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物 制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展 了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚 丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃ 下正常工作。 • 超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用1～2年 。暂时不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％ 叠氮化钠NaN3 中保存。
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1.1 盐析法
• 定义：盐析一般指溶液中加入无机盐而使某种蛋白质溶解 度降低而析出的过程。 • 原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水 分子，使溶液中自由水分子数减小，从而破坏蛋白质表面 的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
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1.1 盐析法
• 盐类的选择：价格低； 溶解度好； 溶解过程中产热少； 盐溶液密度与沉淀的密度有明显差别。
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1.3 等电点沉淀法
• 原理：两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低。 • 适用范围：只适用于水化程度不大、在等电点时溶解度很 低的蛋白质，如酪蛋白。对于亲水性很强的蛋白质，在等 电点附近仍然有很大的溶解度，用等电点法沉淀不完全。 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。 • 优缺点： 优点：很多蛋白质的等电点在偏酸性范围内，调节pH时所 需要的无机酸价格低，操作也比较方便。 缺点：对低pH敏感的蛋白应避免使用此法。
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3. 真空冷冻干燥法
3.1 原理 3.2 操作过程
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3.1 原理
冻干法是指将蛋白 质溶液在低温下冻结 ，然后在真空条件下 升华干燥，除去冰晶 ，待升华结束后再进 行解吸干燥，除去部 分结合水的干燥方法 ，最终达到浓缩蛋白 质溶液的目的。
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3.1 原理
残留溶剂降低到足以 抑制微生物生长或化 >80% 的溶 学反应发生的水平， 剂被除去， 同时保持了冻干蛋白 冷冻速率 残留的溶剂 的活性和完整性。 会影响最 以湿气的形 终产品的 式吸附在产 质量。慢 品上。 速冷冻， 快速冷冻。
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1.1 盐析法
• 硫酸铵盐析法的注意事项： （1）由于蛋白质沉淀的密度与硫酸铵饱和溶液的密度相 近，因此离心分离沉淀物时一般需要高速离心机。 （2）硫酸铵会使溶液略微酸化，可用氨水进行调节。 （3）注意饱和度表中规定的温度，加入固体硫酸铵盐后 的体积变化已考虑在表中； （4）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才 过滤或离心。离心多用于低浓度硫酸铵溶液，而过滤多用 于高浓度硫酸铵溶液； （5）硫酸铵中可能含有少量的重金属离子，使用前必须 用H2S处理。
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1.4 生成盐复合物沉淀法
蛋白质可生成盐类复合物沉淀，主要方法： （l）与酸性功能团作用的金属复合盐法（如铜盐、银盐 、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等），沉淀可通以H2S使金属 变成硫化物而除去； （2）与碱性功能团作用的有机复合盐法（如苦味酸盐、 苦酮酸盐、丹宁酸盐等），沉淀加入无机酸并用乙酸萃取 ，或用离子交换法除去。 （3）无机复合盐法（如磷钨酸盐、磷钼酸盐等）。 但值得注意的是，重金属、某些有机酸与无机酸和蛋 白质形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用 时必须谨慎。
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1.2 低温有机溶剂沉淀法
• 优缺点： 优点：（1）分辨力高于盐析法，即蛋白质只在一个比较 窄的有机溶剂浓度下沉淀； （2）沉淀不用脱盐，过滤更为容易。
缺点：容易使蛋白质变性失活，操作要求在低温下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0~4℃低温下进行。蛋 白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。
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2.1 透析袋吸附法
• 透析袋吸附法在透析技术的基础 上改良而来的。 传统的透析是基于分子质量大小 的液相分离技术，它由透过半透 膜的选择性扩散来实现。但是纯 粹的透析主要用于除去小分子类 的溶质，而要达到浓缩（即除去 溶剂）的目的则费时较长。 透析袋吸附法是将透析液换成可 以吸水的溶液或者固体吸附剂， 这样可实现很好的浓缩作用。