蛋白质溶液的浓缩方法
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蛋白质溶液的浓缩方法
1 蛋白质种类和特性 2 蛋白质浓缩 3 常用浓缩方法 4 小结与展望
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蛋白质溶液的浓缩方法
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 胶体性质 – 蛋白质的分子量在1万-100万之间，直径在1-100nm 之间，属于胶体粒子。蛋白质的水溶液是一种比较稳 定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多 极性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2 等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容 易在蛋白质颗粒外面形成—层水膜。
• 常用的浓缩方法： »沉淀法（蛋白质的沉淀性质） »吸附法（吸水剂） »冻干法（真空低温脱水） »超滤法（分子量）
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1. 沉淀法
1.1 盐析法 1.2 低温有机溶剂沉淀法 1.3 等电点沉淀法 1.4 生成盐复合物沉淀法 1.5 选择变性沉淀法 1.6 非离子多聚物沉淀法
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• 硫酸铵盐析法的注意事项： （1）由于蛋白质沉淀的密度与硫酸铵饱和溶液的密度相 近，因此离心分离沉淀物时一般需要高速离心机。 （2）硫酸铵会使溶液略微酸化，可用氨水进行调节。 （3）注意饱和度表中规定的温度，加入固体硫酸铵盐后 的体积变化已考虑在表中； （4）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才 过滤或离心。离心多用于低浓度硫酸铵溶液，而过滤多用 于高浓度硫酸铵溶液； （5）硫酸铵中可能含有少量的重金属离子，使用前必须 用H2S处理。
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• 影响因素： （1）温度：低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶 解度，提高提取效率； （2）样品浓度和pH： 与盐析法中的作用基本相同； （3）金属离子：一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH 下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在 水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白 质的生物活性。 （4）离子强度：盐浓度太高或太低都对分离有不利影响 ，对蛋白质和多糖而言，盐浓度不超过5%比较合适，使 用的乙醇量不宜超过二倍体积。
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• 优缺点： 优点：（1）分辨力高于盐析法，即蛋白质只在一个比较 窄的有机溶剂浓度下沉淀； （2）沉淀不用脱盐，过滤更为容易。
缺点：容易使蛋白质变性失活，操作要求在低温下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0~4℃低温下进行。蛋 白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。
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• 原理： （1）甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂
介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力； （2）上述有机溶剂是强亲水试剂，破坏蛋白质胶体
分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
• 有机溶剂的选择： 有机溶剂首选能与水混容的，常用乙醇、甲醇、丙酮
等。大多数蛋白质通过加入等体积的丙酮或四倍体积的乙 醇就可以沉淀下来，但也造成的了蛋白质溶液的稀释，所 以蛋白质溶液的浓度一般要在1mg/ml以上。
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• 原理：两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低。
• 适用范围：只适用于水化程度不大、在等电点时溶解度很 低的蛋白质，如酪蛋白。对于亲水性很强的蛋白质，在等 电点附近仍然有很大的溶解度，用等电点法沉淀不完全。 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。
• 原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水 分子，使溶液中自由水分子数减小，从而破坏蛋白质表面 的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
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• 盐类的选择：价格低； 溶解度好； 溶解过程中产热少； 盐溶液密度与沉淀的密度有明显差别。
一般来说：高价阴离子：PO43- > SO42- > Ac-和NO3-， 单价阳离子：NH4+ > K+和Na+， 高价阴离子的沉淀效果优于单价阳离子。
• 优缺点： 优点：很多蛋白质的等电点在偏酸性范围内，调节pH时所 需要的无机酸价格低，操作也比较方便。 缺点：对低pH敏感的蛋白应避免使用此法。
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蛋白质可生成盐类复合物沉淀，主要方法： （l）与酸性功能团作用的金属复合盐法（如铜盐、银盐 、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等），沉淀可通以H2S使金属 变成硫化物而除去； （2）与碱性功能团作用的有机复合盐法（如苦味酸盐、 苦酮酸盐、丹宁酸盐等），沉淀加入无机酸并用乙酸萃取 ，或用离子交换法除去。 （3）无机复合盐法（如磷钨酸盐、磷钼酸盐等）。
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蛋白质溶液的浓缩方法
e.g 硫酸铵盐析法浓缩蛋白质溶液 硫酸铵因其价格便宜、溶解度高且对温度的敏感性低
而被常用于沉淀蛋白质。
操作方法：（1）加入固体硫酸铵，适用于要求饱和度较 高而不增大溶液体积的情况； （2）加入饱和硫酸铵溶液，适用于要求饱和度不高而原 来溶液体积不大的情况； （3）透析平衡法（多用于结晶），先将盐析的样品装于 透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫 酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后目的蛋白析出。
• 沉淀法浓缩蛋白质溶液，指将蛋白质分子凝聚从溶液中析 出的现象。
• 沉淀法是比较传统的分离纯化蛋白质的方法，目前仍然广 泛使用。一般常用的沉淀浓缩有硫酸铵沉淀法、（低温） 有机溶剂沉淀法、丙酮沉淀法、免疫沉淀法、三氯醋酸沉 淀法、聚乙二醇沉淀法等。
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• 定义：盐析一般指溶液中加入无机盐而使某种蛋白质溶解 度降低而析出的过程。
但值得注意的是，重金属、某些有机酸与无机酸和蛋 白质形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用 质对某些物理或化学因素的敏感性不同， 有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。
• 两性解离和等电点 – 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，在一定的pH条 件下，能解离为带电基团从而使蛋白质带电。
• 蛋白质的变性
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蛋白质溶液的浓缩方法
• 蛋白质溶液的浓缩连接了蛋白质的提取和蛋白质的分离纯 化，是获取高浓度或高活性蛋白质的重要步骤。
• 浓缩目的：提高蛋白质浓度；减少样品体积； 便于进一步纯化。