敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。

主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。

所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。

嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。

一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。

二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。

免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。

在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。

三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。

基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。

首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。

下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。

Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。

它的鉴定主要根据毛色去鉴定。

注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。

它们的毛色不同。

因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。

五、ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。

ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。

常见问题1、你们是否接受打靶载体或者重组的胚胎干细胞之后的服务工作？目前公司主要提供基因敲除定制化的全程服务，同时也可以承担打靶载体构建、细胞转染和显微注射等服务项目。

2、您公司的C57BL/6 野生型胚胎干细胞株是否可以出售？C57BL/6 野生型胚胎干细胞株我们是不对外出售的。

这个细胞株是我们自主研发并具有自主知识产权的细胞系。

鉴于基因敲除工作的重要环节以及是否可以得到一个比较好的Germline transmission的关键就是是否有一个高质量的ES cell line，因此这个ES cell line已经成为我们公司的最核心的资产。

所以，非常抱歉！我们不能对外出售，请您谅解！3、公司最后提供给客户多少只F1代小鼠？有相关的检测方法或检测报告吗？我们最后提供给客户的是不少于两只的F1杂合子小鼠。

一般情况下，我们可以提供更多的F1代杂合子小鼠。

我们会有相关的检测方法和最终的检测报告提供给您，您也可以自己进行核实检测！也可以在我们的帮助之下完成。

4、客户委托公司制备基因敲除小鼠需要提供哪些材料？客户只需要告诉我们要操作的基因名字和您的特殊要求。

对于没有经验的客户，我们会免费为您提供咨询，了解您的需求，以及想得到的结果，为您提供最佳的设计方案。

我们会对该基因进行序列分析后，给您一个初步的设计，双方沟通没有问题后，我们会签署一份技术服务合同，然后我们进行BAC的订购，开始模型的制备。

直到您得到F1代小鼠。

5、公司是否能提供大鼠的基因敲除服务？我们公司现在主要是提供各种基因敲除小鼠模型的制备服务。

有关基因敲除的大鼠模型，我们公司正在对技术进行研发和优化。

所以现在还不能为您提供基因敲除的大鼠，非常抱歉！请关注我们公司的网站。

我们一旦开始提供大鼠基因敲除服务，我们将在公司网站上公布（估计在2013年）。

6、公司提供基因敲进服务时，对敲进的基因有哪些要求？所能接受的最大分子量是多少？公司提供基因敲进服务时，对于特殊的基因，需要客户提供cDNA信息，插入基因片段的大小一般在5K以下，效果比较好。

对于5-10kb的，效率可能会低一些。

对于大片段的敲进，由于重组效率将大大地降低，我们可能会收取较多的费用。

7、公司会安排多少个阳性克隆进行囊胚注射？我们通常在注射的时候会安排四个克隆，但是我们做阳性重组胚胎干细胞筛选的时候通常要求得到不少于6-8个克隆，以备筛选更好的注射克隆之用。

而且，我们的最终目标是要得到优良的Germ-line transmission。

8、公司如何对转染的ESC进行筛选，如何确保目的基因的正确插入?我们在构建打靶载体时会引入NEO抗性基因筛选标记，同时在打靶载体特定位置引入酶切位点。

打靶载体电转细胞后，首先进行G418的抗性初筛。

之后，我们会通过两次Southern 杂交实验，对插入位点的两端进行验证，以此确保目的基因完整的插入到正确位置，以及其它位置没有随机插入。

9、公司制备完成的小鼠如何运输？公司在根据客户的要求得到F1杂合子小鼠后，我们会根据客户的具体要求选择运输方式与运输日期。

如果您没有特殊要求，我们会通过专业的实验动物运输公司，以空运的方式安排运输。

10、何谓Flox小鼠？所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。

这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。

这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。

11、条件性敲除设计中，为什么在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统？在设计中，其中的一个系统是为了把抗性基因去掉。

另一个系统是为了把目的基因去掉。

Frt-Flip系统或Cre-Loxp系统都可以用来放在抗性基因或是目的基因外显子的两侧。

理论上是没有区别的。

只所以“在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统”，主要有以下几个原因：1）工具鼠：Cre-LoxP系统已经用了将近20年了，科学家研发了很多的Cre工具鼠。

其实目前绝大部分工具鼠都是Cre工具鼠。

现在大家做一个Flox(Flanked By LoxP)小鼠花费很多的时间和金钱，都会希望自己的小鼠与更多的工具鼠交配，得到更多的结果。

2) Flip酶的活性比较低。

Flip酶是从酵母中分离出来的。

其最适温度是30度，而小鼠的体温是37度。

尽管现在有些实验室对Flip的37度适应性做了优化，但应该还是没有Cre的活性好。

把Frt放在抗性基因的两侧，得到小鼠之后，跟Flip Deleter小鼠交配，筛选出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。

即使Flip的活性不高，也可以得到Flox 小鼠。

这些Flox小鼠可以跟各种Cre工具鼠交配，得到条件性敲除小鼠。

反过来，如果用Cre来去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。

这种情况下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。

如果看5、6年前的文章，大家其实是把Loxp不仅放在要敲除基因的两侧，也用来敲除抗性基因(NeoR)。

那个时候筛选起来特别麻烦。

因为要做大量的筛选，筛出只敲掉抗性基因，而没有敲掉目的基因的Flox小鼠。

需要很多的时间和精力。

12、怎样用最简单的描述区分基因敲除、基因敲进、基因敲降、和转基因1）基因敲除（Knockout)：把一个基因从基因组里面全部或部分拿掉；2）条件性基因敲除（Conditional KO): 把一个基因从特定细胞的基因组里面全部或部分拿掉；3）基因敲进（Knockin)：在基因组里放一个外源基因（如GFP, LacZ, TdTomato等）；4）基因敲降（Knock-down): 通过降解mRNA的方法降低蛋白的表达水平（一般是用microRNA 或siRNA)。

5）转基因：在体内过表达一个特定基因，就象在细胞系里用高水平表达载体表达一个蛋白。

13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到杂合子是什么原因？高嵌合率不代表种系传递就好。

许多实验室，包括我们公司，都发现特别高嵌合率的嵌合体小鼠不能交配产仔。

原因不是很清楚,这应该跟打靶的基因是不是性染色体没有关系。

可以检查一下嵌合体小鼠是不是有隐睾的现象。

另外，毛色看到的嵌合率与生殖细胞的嵌合率不一定完全一致。

也有人认为雄性ES细胞注射到雌性囊胚使得胚胎发育过程中性别转化不完全，造成的所谓不男不女现象。

现在好像还没有一个定论知道到底是什么原因。

14、ROSA26位点插入外源基因的设计原理是什么？Rosa26位点基因敲入,在原来的设计中，目的基因cDNA上游带有一段转录终止序列“Stop”（3个拷贝的SV40多聚A序列，tPA）,转录终止序列的两端各有一个Loxp位点，将此结构定点嵌入Rosa26基因位置，整个结构的转录受Rosa26启动子控制。

在没有Cre的情况下，由于Rosa26启动子与目的基因之间“STOP”的存在，目的基因不能被表达。

如果有Cre表达， Cre重组酶将去除“STOP”，Rosa26启动子就可以启动目的基因表达。

但是，由于Rosa26启动子是一个弱启动子，其启动能力有限，目的基因经常达不到研究人员需要的表达水平。

为了解决这一问题，可以对原Rosa26基因敲入系统做改进，引入了一个强效的启动子，如CAG启动子, 该启动子由鸡actin启动子和CMV增强子融合而成，用这一杂合启动子代替Rosa26启动子，从而高效地启动目的基因表达。

15、在做条件性基因敲除小鼠模型的设计时，为什么不能从exon1敲除？条件性基因敲除小鼠模型的设计，不能从exon1开始敲除，原因是loxp site 最好不要插入到启动子区域，因为很难预测启动子和所有调控元件的位置，loxp的插入很有可能会因为破坏了启动子或调节原件而影响野生型蛋白的表达，所以条件性敲除设计中，一般都不会从exon1开始敲除。

16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1）目前用于基因沉默的技术方法主要是siRNA。

对于一个待敲除的候选基因，需要设计多个siRNA，并对每一个siRNA进行验证（一般利用细胞系），这就造成筛选具有干扰作用siRNA的选择难度相当大。

2）一般情况下，RNAi对于基因的抑制不会很完全。

在体外细胞实验中，我们一般只是观察1-5天，以验证siRNA的抑制功能。

而在小鼠体内，siRNA尽管可以降低mRNAs的水平，从而影响蛋白的表达，但并不一定影响基因的功能。