题目浅析重组干扰素的生产姓名杨胜德学号11113173专业生物工程学院微生物指导教师鞠守勇二零一二年十一月目录摘要﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 关键词﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Abstract﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 Key words﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍3 前言﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1.基因工程菌的构建﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1目的基因的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.1干扰素mRNA的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.2 cDNA的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍4 1．1.3 cDNA第二链的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．2 大肠杆菌质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3重组质粒的获取﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.1重组质粒的合成﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.2 重组DNA的转化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍5 1．3.3重组体的筛选与鉴定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍52.目的基因的表达﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍53.产物的提取与纯化﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍54.质量控制和要求﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍6 4.1半成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍64.2成品检定﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍65.参考文献﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍76.致谢﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍﹍8浅析重组干扰素的生产·摘要干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。
具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。
·关键词干扰素；基因重组；质粒Briefly Analysis of recombinant interferon productionAbstractInterferon is a group with multiple functions of active protein (mainly glycoprotein), is a kind of monocytes and lymphocytes cytokines. It has broad-spectrum antiviral, effect of cell growth, differentiation, and modulation of immune function and other biological activity.Key wordsInterferon,gene recombinant, plasmid前言干扰素（IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白[1]，具有广泛的抗病毒，抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。
早期的干扰素是用病毒诱导人白血球（白细胞）产生的，产量低，价格昂贵，根本不能满足需要。
现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来进行生产。
一般选用大肠杆菌作为受体菌[2]，利用pBR322质粒作为载体进行干扰素的生产。
pBR322质粒是目前在基因工程中研究得最多，使用最早且应用最广泛的一种大肠杆菌质粒。
此载体有两个标记基因，分别为抗四环素基因（Tcr）和抗氨苄青霉素基因（Ampr），在氨苄青霉素基因内部有ScaⅠ,Pv uⅠ,PstⅠ三种限制性内切酶位点，外源基因的插入会引起插入失活，因此可以筛选出抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌来克隆。
干扰素根据其分子结构和抗原性的差异可分为α、β、γ、ω4个类型[3]，通常分为三种。
Ⅰ型：有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型。
Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等用。
Ⅱ型：只有IFN-γ，且只有一种亚型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物学活性为免疫调节作用。
Ⅲ型：即IFN-λ1（IL-29）、IFN-λ2（IL-28a）和IFN-λ（IL-28b）。
IFN-ω属于IFN-α家族，其结构和大小与其它IFN-α稍有差异，但抗原性有较大的不同。
1.基因工程菌的构建1.1目的基因的获取在干扰素重组DNA成功以前,人们对干扰素的结构一无所知,因此不能人工合成基因,而且人染色体上干扰素基因拷贝数极少(大约只有1.5%),加上提取上的困难,所以不能直接分离干扰素的基因,而是通过mRNA反转录成cDNA[4]1．1.1干扰素mRNA的获取通过诱生的白细胞或成纤维细胞，提取全RNA。
方法是在高速的离心机上以10000r/min 离心1min。
因为mRNA 3’末端含有polyA结构，即含有大量的寡聚腺嘌呤，所以可以寡dT-纤维素柱层析来获取mRNA，用低盐溶液和蒸馏水洗脱，经5%蔗糖密度梯度离心提取12SmRNA。
1.1.2 cDNA 的合成由于cDNA有3’poly末端,可用寡聚（dt）作引物，在反转录酶的催化下，开始cDNA 的合成。
往往在合成的过程中加入一种放射性标记的dNTP，在反应后通过测定放射性标记的dNTP的渗入量，；来计算cDNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物分子的大小，探索最佳的反应条件。
一次好的反转录反应可使寡聚（dt）选出的mRNA有5%-30%被合成cDNA。
1.1.3 cDNA 第二链的合成先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板来合成cDNA的第二链。
由于第一条cDNA链3’末端往往会形成一个发卡结构，所以，可用DNA聚合酶Ⅰ从这一点开始催化合成cDNA第二链。
最后用核酶SⅠ专一性切除发夹形结构。
1.2 大肠杆菌质粒获取取大肠杆菌培养液3ml于微量离心管，以10000r/min离心1min，去掉上清液后，用滤纸吸干残液，加入100µl溶液Ⅰ（葡萄糖，Tris-cl，EDTA,PH=8.0），吹散菌株后置冰上5min。
加入200µl溶液Ⅱ（NaOH,1%SDS）轻柔颠倒后混匀，置冰山5min,再加上150µl溶液Ⅲ（醋酸钾，醋酸），混匀后置冰上5min。
然后在4℃，12000r/min离心5min，吸取上清液至另一离心管，再加两倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置冰上5min，接着再4℃、12000r/min离心5min，弃去上清，加800µl 70%乙醇漂洗，弃上清液，除尽乙醇后自然风干[5]。
1.3重组质粒的获取1．3.1重组质粒的合成在体外用PstⅠ酶切割pBR322质粒，使其产生黏性末端，再用PstⅠ酶切割目的基因，使它们获得相同的黏性末端，然后用DNA连接酶连接磷酸二酯键[6]。
1.3.2重组DNA的转化重组质粒在完成体外构建之后，必须导入到合适的受体细胞中，这样目的基因才能实现扩增，纯化和表达等，把以噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA导入到受体细胞的过程称为转染（transfection）[7]。
一般细菌在感受态（competence）能从周围环境中摄取DNA分子，而细菌不是在任何情况下都能产生感受态的，所以可采用人工的方法诱导感受态的产生，常用的有氯化钙转化法和电转化法。
利用钙离子和改变温度的方法，使重组质粒进入到受体细胞-大肠杆菌。
1.3.3重组体的筛选、鉴定由于pBR322质粒PstⅠ酶识别位点位于抗氨苄青霉素（Ampr）内部（如图）[8]，故插入目的基因后，会引起插入失活，失去抗氨苄青霉素的能力，不能在含有氨苄青霉素培养基中生长，但由于pBR322质粒有抗四环素基因（Tcr），故可在含有氨苄青霉素的培养基中生长。
将重组菌体充分稀释后滴到多孔板上培养，可以认为每个多孔板均为单菌落。
向分别含有氨苄青霉素和四环素的培养基上滴加菌体，筛选出能在四环素上生长而不能在氨苄青霉素上生长的菌体。
●2目的基因的表达人干扰素α2b（以α2b为例）基因工程菌为SW-IFN α2b/E.coli DH5,质粒用Pl启动子，含氨苄青霉素抗性基因。
种子培养基含蛋白胨1%、酵母抽提粉0.5%、Nacl 0.5%.分别接种人干扰素α2b基因工程菌到四个装有1000ml三角瓶中，30℃摇床培养10h，作为发酵种子使用。
用装有10L发酵液的15L发酵罐进行发酵，发酵培养基由蛋白胨1%、酵母抽提粉0.5% 、NH4CL0.01%、NaCl 0.05%、Na2HPO4 0.6%、CaCl2 0.001% 、KH2PO4 0.3% 、MgSO4 0.01%、葡萄糖0.4%、氨苄青霉素50㎎/ml及少量防泡剂组成，PH6.8。
诱导转速500r/min，通气量为1:1vvm，溶氧为50%。
30℃发酵8h，然后在42℃下诱导2~3小时即可完成发酵。
[9]●3产物的提取与纯化发酵完毕冷却后进行4000r/min离心30min，除去上清液，得湿菌体1000g左右。
取100g 湿菌体重新悬浮于500ml 20mol/L磷酸缓冲液中（PH7.0），于冰浴条件下进行超声破碎。
然后以4000r/min离心30min。
取沉淀部分，用100ml8mol/L尿素溶液，20mmol/L磷酸缓冲液(PH7.0)，0.5%mmol/L二硫基苏糖醇室温搅拌抽提2h，15000r/min离心30min。
取上清液用同样的缓冲液稀释尿素浓度为0.5mol/L，加二硫基苏糖醇至0.1mmol/L，4℃搅拌15h，15000r/min离心30min除去不容物。
上清液经截流相对分子质量为10000的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素α2bε溶液经过Sephadex G-50分离[10]，层析柱2㎝×100㎝，先用20mmol/L磷酸缓冲液（PH7.0）平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素α2b部分，经SDS-PAGE检查。