5. 按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。

注意一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。

6. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。

7. 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1：1体积比加入样品处理液，在100℃加热5min以使蛋白质变性。

8. 浓缩胶聚合完全后（30-60 min），小心移出梳子。

将凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

二、上样电泳
1. 按预定顺序加样，加样量通常为10～25μL。

电泳检测样品至少包括：蛋白Marker、上样液（原液）、上样后的穿透液、10mM 咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。

2. 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/ cm。

当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/ cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm，然后关闭电源。

3. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。

紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色
染色时间：现温度下不少于2h。

脱色需3～10小时，期间应多次更换脱色液直至背景清楚。

为了永久性记录，应尽快对凝胶进行拍照。

四、实验结果与讨论
1、质粒的提取、酶切电泳图谱
1 2 M
图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱
1：酶切后的质粒2：质粒M ：Marker 1、2：质粒4、5：酶切后质粒
观察结果：通过对比第三组和第四组电泳图谱，可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面，并且质粒泳道条带比较多；电泳条带模糊，呈凹凸形状，拖尾现象比较严重，不能很明显地观察结果。

原因分析：
1：破菌后的原液 2：50mM 咪唑冲洗液 3：100mM 咪唑冲洗液
4：250mM 咪唑冲洗液 我们以第三组的穿柱液作为标本
2）我们从图谱中可以看出目标蛋白在50mM 咪唑洗脱液和100mM 咪唑洗脱液中被洗脱下的量是比较多的，因此我们可以在50-10mM 之间寻找最适咪唑液的浓度。

3）图3-2是未加IPTG 诱导目标蛋白产生的对照，通过与图3-1对比，可以发现在33kD-45kD 之间没有蛋白条带的产生，而加IPTG 的组有明显的蛋白质条带，因此可知在诱导外源基因表达时诱导剂是必不可少的。

五、实验总结 1）通过本次试验，学到了很多以前没有接触过的实验技术，也锻炼了一下以前学过的方法，更从实验中的小细节领悟到许多知识，总体来说收获很大。

2）在实验中要养成良好的习惯，不忽略任何小细节，加强时间观念，加强团队合作精神，及时纠正自己的不良操作规范，不懂得东西要及时请教他人。

3）最后，感谢三位老师的悉心指导，感谢第四组所有成员的共同努力，感谢所有同学在实验过程中对我们的帮助。

图3-2 对照组，未加IPTG 诱导 结果分析： 1）通过SDS-PAGE 鉴定图谱3-1我们可以看出，通过IPTG 的诱导，我们成功得
到了目标蛋白。

通过与Marker 标准蛋白对比，可以看到目标蛋白分子量在33kD-45kD 之间；原液中含有大量的目标蛋白，穿柱液中没有，说明目标蛋白被吸附到了层析柱中。

通过第三组和第四组结果的比对，可以看到第四组在不同浓度咪唑洗脱液得到的
目标蛋白的量比第三组多，有可能是因为第四组加样量多于第三组，或者是50mM 没
有完全洗脱便开始100mM 咪唑进行洗脱。

1：原液 2：穿透液 3：50mM 咪唑洗脱液
4、100mM 咪唑洗脱液
5、250mM 咪唑洗脱液。