分子生物学实验：专业：学号：目录实验一细菌培养实验二质粒DNA提取实验三琼脂糖凝胶电泳实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验五聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验六地高辛标记的Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。

它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。

当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。

然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。

此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。

实验室中最常用的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养皿2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。

加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟。

这样得到是LB液体培养基。

LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。

（二）细菌的培养（１）在液体培养基中培养1.过夜培养（1）先在LA液体培养基中加入氨苄青霉素，50μl/50ml。

（2）取3~4ml液体培养基加入一只无菌的试管中。

（3）用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。

（4）盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。

２.大体积培养（1）按1∶100（V/V）的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。

（2）于37℃，约200r/min剧烈摇动培养。

（２）在固体培养基中培养细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。

平板划线法分离单菌落（1）采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。

（2）重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。

（见下图）（3）于37℃培养直至长出单菌落。

五、实验结果与讨论LB液体培养基是淡黄色清液，接种大肠杆菌过夜培养后，若有细菌生长，则培养基变浑浊（说明菌体复生长）。

本次实验成功得到大肠杆菌培养液。

实验二质粒DNA的提取一、目的学习碱裂解法提取质粒的原理二、原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。

它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。

目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。

现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。

实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。

其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料含质粒的大肠杆菌DH5α（二）试剂1. LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。

高压灭菌20分钟。

2. LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。

（三）仪器1. Eppendorf管、离心管架2. 10，100，1000μl微量加样器3. 台式高速离心机4. 摇床、高压灭菌锅四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。

（二）提取步骤1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入500μL 的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）2、取1-5 mL 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，10000rpm（~13,400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

【现象：均匀振荡，直至看不见菌块，菌液变为乳白色。

注意：如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低】4、向离心管中加入250μL 溶液P2，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。

【现象：此时菌体裂解，菌液变得清亮粘稠。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA断裂片段。

该步骤操作应快，所用时间不超过5分钟，以免质粒受到破坏。

如果未变得清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

】5、向离心管中加入350μL 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

【现象：产生白色絮状物。

注意：P3加入后应立刻混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

】6、将上一步收集的上清液（只转移800μL上清液）用移液器转移到吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

7、向吸附柱CP3 中加入600μL 漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm （~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

8、重复操作步骤7。

9、将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

【漂洗液中的乙醇残余会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱CP3开盖，置于超净工作台上风干五分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

】10、将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL 洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm（~13,400×g）离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。

(三) 琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA五、实验结果与分析注：泳道5为Ladder，最上方条带为2kb分析：由结果与Ladder比对可知，成功提取出3.5kb的质粒。

六、讨论（一）P1，P2，P3的成分P1：葡萄糖（提供渗透压，避免细胞破裂），RNA酶，盐酸，EDTA（螯合出核酸酶的金属离子，避免DNA被降解）P2：SDS（一种去污剂，易起泡，溶解细胞膜），NaOH（碱性物质，促进肽聚糖水解，帮助裂解细胞膜）P3：醋酸和醋酸钾，PH≈4.8~5.2（二）P1，P2，P3的作用P1：起着悬浮细菌的作用,PH值为中性。

P2：起着裂解细菌的作用,为碱性,这一步又称为碱裂解。

P3为酸性,中合P3.P2加了一倍,P3也加一倍,同样起到中和的作用.当然,如果你用试剂盒提,最后离心上柱的液体量会多一些,一次加不完可两次加入.电泳时在样品中加入溴酚蓝的目的，以及在溴酚蓝中加入甘油和蔗糖的原因1、加入溴酚蓝的目的:（1）溴酚蓝呈蓝色，而蛋白质是白色，在凝胶中不明显。

（2）溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分)小，电泳时速度比蛋白质稍快，因此可用作指示。

（3）可以根据溴酚蓝电泳产生的蓝色条带位置判断电泳结束时间（一般当溴酚蓝跑到末端时停止电泳）。

若无溴酚蓝，不好把握蛋白质电泳到槽底的时间。

如果所有的蛋白质都电泳到了底部，就不能区别出其移动速度对应于相对分子质量的关系。

2、加入蔗糖和甘油的目的: 跑胶前都会在Buffer(缓冲器)里的，并要和样品充分混合，只是因为蔗糖和甘油比重大，可以使样品沉到点样孔中，在点样孔底部铺成一线，避免样品漂逸，从而可以最大限度地跑到胶里去，得到更好的实验结果。

实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA一.目的学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。

二.原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测。

其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。

而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。

电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。

如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。

在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。

增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。