附件1：
脑蛋白水解物（供口服用）
Naodanbai Shuijiewu
Cerebroprotein Hydrolysate
本品系自健康猪脑经脱脂、酶水解、干燥得到的产物。

按干燥品计算，每1g中总氮（N）含量应为120mg~160mg，肽含量应为350mg～500mg。

【制法要求】本品应自检疫合格的猪脑中提取制备，生产过程均应符合现行版《药品生产质量管理规范》要求。

【性状】本品为淡黄色至棕黄色粉末或块状物。

【鉴别】取本品0.2g，加水20ml溶解，滤过，以滤液作为供试品溶液进行以下试验：（1）取供试品溶液5ml，加茚三酮试液数滴，加热，溶液显蓝紫色。

（2）取供试品溶液5ml，加10%氢氧化钠溶液2ml使成碱性，加0.5％硫酸铜溶液3滴，溶液显紫色。

（3）精密称取脑蛋白水解物对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含总氮1.6mg 的溶液，作为对照品溶液。

照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长250mm，内径4mm，粒径5μm）；以0.1%（V/V）三氟醋酸水溶液为流动相A，以0.085%三氟醋酸乙腈溶液-0.1%三氟醋酸溶液（80:20）为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml；检测波长为276nm。

时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）
0 100 0
40 50 50
45 0 100
53 0 100
55 100 0
65 100 0
精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品溶液的色谱图与对照品溶液色谱图的相似度（扣除色氨酸峰后）不得低于0.8。

【检查】酸度取本品0.20g，加水20ml溶解，依法测定（中国药典2010年版二部附录Ⅵ H），pH值应为5.0~7.0。

蛋白质取本品0.2g，加水2ml溶解，滤过，加20%磺基水杨酸溶液2ml至滤液中，混匀，溶液应澄清。

活力测定取本品适量，加水溶解并稀释制成每1ml约含总氮6mg的溶液，除菌过滤，取滤液适量加10%小牛血清培养液制成每1ml中含氮量为60µg的溶液。

照活力测定法（见附）测定，修复率不得低于100%。

干燥失重取本品，置五氧化二磷干燥器内，在80℃减压干燥至恒重，减失重量不得过4.0％（中国药典2010年版二部附录VIII L）。

炽灼残渣不得过7.5%（中国药典2010年版二部附录Ⅷ N）。

重金属取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查（中国药典2010年版二部附录VII H 第二法），含重金属不得过百万分之二十。

微生物限度取本品10g，依法检查（中国药典2010年版二部附录XI J），本品1g中细菌总数不得过1000cfu，霉菌及酵母菌总数不得过100cfu，并不得检出大肠埃希菌；另取本品10g，依法检查（中国药典2010年版二部附录XI J），不得检出沙门菌。

【含量测定】肽取本品适量（约相当于肽50mg），精密称定，置消化管中，加盐酸适量（使供试品完全浸没并不超过容器的2/3体积），充氮封口，置110℃水解20小时，放冷，启封，将水解液全量转移至蒸发皿中，水浴蒸发至干，加水使残留物溶解并稀释至适宜浓度，作为总氨基酸测定用供试品溶液；另取本品适量，加水稀释至适宜浓度，作为游离氨基酸测定用供试品溶液，用氨基酸分析仪或适宜的高效液相色谱仪进行测定。

另取相应的氨基酸对照品（见下表），精密称定并稀释制成合适浓度，作为对照品溶液，同法测定。

按外标法或以合适的氨基酸为内标以峰面积计算各氨基酸含量（色氨酸除外）。

以水解后总氨基酸含量减去游离氨基酸含量即为肽含量。

氨基酸对照品
门冬氨酸(C4H7NO4) 甘氨酸(C2H5NO2) 缬氨酸(C5H11NO2) 苯丙氨酸(C9H11NO2)
亮氨酸(C6H13NO2)
谷氨酸(C5H9NO4) 苏氨酸(C4H9NO3) 甲硫氨酸
(C5H11NO2S)
丝氨酸(C3H7NO3) 丙氨酸(C3H7NO2) 色氨酸(C11H12N2O2) 赖氨酸(C8H714N2O2) 组氨酸(C6H9N3O2) 精氨酸(C6H14N4O2) 异亮氨酸(C6H13NO2) 脯氨酸(C5H9NO2) 总氮取本品约10mg，精密称定，依法测定（中国药典2010年版二部附录VII D第二法）。

【类别】脑功能改善药.
【贮藏】遮光，密封保存。

【制剂】（1）脑蛋白水解物片（2）复方脑蛋白水解物片（3）复方吡拉西坦脑蛋白水解物片
附： 活力测定法
本法系通过损伤PC12细胞后加入本品，采用MTT 法测定细胞修复率作为活力测定指标。

试剂 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3） 取氯化钠8.0g 、氯化钾0.2g 、无水磷酸氢二钠1.15g 及磷酸二氢钾0.2g ，加超纯水1000ml 溶解后，湿热灭菌（中国药典2010年版二部附录ⅩⅦ）。

10%小牛血清培养液 取RPMI －1640培养液90ml ，加已灭活的新生小牛血清10ml 。

0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液 取胰蛋白酶0.25g 及乙二胺四醋酸二钠0.02g ，加0.01mol/L 磷酸盐缓冲液100ml 溶解后，用5.6%碳酸氢钠溶液调节pH 值至7.2，滤过除菌（滤膜孔径为0.22μm ），-20℃保存。

0.5mmol/L 过氧化氢溶液 取过氧化氢浓溶液1.0ml 加水稀释至100ml ，再取28.3µl 加10%小牛血清培养液稀释至5.0ml 。

噻唑蓝（MTT ）溶液 取MTT50mg ，加0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3）10ml 溶解后，滤过除菌（滤膜孔径为0.22μm ），2～8℃保存，使用不超过两周。

测定法 用10%小牛血清培养液培养3～8代的PC12细胞至对数增长期，用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10%小牛血清培养液稀释至每1ml 中含（0.8～1.2）×105个细胞，将上述细胞混悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔100µl ，以10%小牛血清培养液100µl 作为空白对照组，置37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养24小时。

供试品组，每孔加供试品溶液100µl ，正常细胞组、损伤细胞组、空白对照组每孔分别加10%小牛血清培养液100µl ，每组设3个复孔。

置37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养24小时。

供试品组、损伤细胞组分别加入0.5mmol/L 过氧化氢溶液 50µl ，剩余孔加入10%小牛血清培养液50µl ，置37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时。

结束培养前4小时取出培养板，吸去培养液，每孔加入0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3）洗一次，然后再在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液（pH7.3）100µl 和MTT 溶液20µl ，继续培养。

培养结束后，吸出培养液，每孔加入二甲基亚砜100µl ，摇匀，放置5分钟后，在酶标仪上以550 nm 的波长处分别测定其吸光度A 值。

修复率％=Ag-As Az-As
×100% 式中 Ag 为供试品组平均吸光度－空白对照组平均吸光度；
As 为损伤细胞组平均吸光度－空白对照组平均吸光度；
Az 为正常细胞组平均吸光度－空白对照组平均吸光度。