五、利用限制性内切酶克隆
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设
计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同 酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸 露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加 上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对 其识别位点进行有效切断。 酶切位点（内切酶的识别序列）要加在引物的 5‘端 具体为：5'-保护碱基+酶切位点+引物序列-3'
四、使用限制酶注意事项
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进
一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各 自的最适盐浓度。 若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先 使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。 也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后臵-70℃低温 冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶 切反应。
割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。
第二类内切酶
酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸
识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴
同尾酶；切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的 一类限制性内切酶。
这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相
同的粘性末端。 由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补 作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限 制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在， 不能被原来的限制性内切酶所识别。
双酶切
同步双酶切 分步酶切
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶
切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要 求，然后加入第二种酶完成双酶切反应
操作注意事项
1.吸样量一定要准确
2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶
3.要求在冰上操作，并充分混匀，
4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防 污染。
二、限制性内切酶类型
第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附
近的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的 核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 的固定位臵上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别 和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸 顺序的DNA片段。 第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文 顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位臵上切
同裂酶；有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷
酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可 能不同，识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶， 识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。
三、酶切效率影响因素
DNA纯度
缓冲液性内切酶不受RNA或单链DNA的影响
5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进 入管内造成实验失败。
限制性内切酶酶解中常见的问题 和原因
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失
活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限 制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不 存在该酶的识别顺序。 2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正 确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部 分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。 3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力； ②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它 DNA。
失活以终止反应。
4、12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。 5、取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖 6、结果观察
凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约 100V30 ～ 60min 。
酶切反应体系(50μl)
模板DNA：5μl 限制性内切酶10×Buffer：10μl (2×) 酶：各0.5 μl 去离子水：34 μl
不完全酶切
2000bp 1000bp 750bp
完全酶切
2000bp 1000bp 750bp 500bp
Marker-PUM 2686bp 2050bp 1507bp
周二
1119bp
878bp 500bp
周三
周三
周五
2692bp+800bp=3492bp 3492bp*0.7=2444bp
周五
目标片段
2000bp 1000bp 750bp 500bp
酶切验证
23.1kb 9.4kb 6.5kb 4.3kb 2.3kb 2.0kb 2692bp
实验六、酶切
一、限制性内切酶酶切实验原理
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一
种内切核酸酶。一般是在原核生物中发现，它可 以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入，但对自己的 DNA却无损害作用。由于这 种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制 性内切酶。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，在DNA片段的5’端为P，3’端为OH。
pMD®18-T Vector的结构
酶切技术
重组质粒DNA插入片段800bp 本实验所用限制性核酸内切酶为BamH I和Hind
III
磷酸二脂键断裂
酶切反应步骤
1、酶切体系的配备
在一无菌1.5ml Eppendorf管中加入 轻轻混匀，12000rpm离心5sec。
2、37℃水浴1h。 3 、将 Eppendorf 管臵 65℃ 水浴中 10min ，通过加热使酶