纯度和浓度

加样顺序：水+缓冲液+DNA+酶


影响限制性内切酶的因素： DNA制品中的污染（蛋白质、酚、氯仿、 乙醇、EDTA、SDS) 解决办法： 增加酶反应体积以稀释可能的抑制剂 增加酶作用单位 延长反应时间

酶的星号活性:
改变酶切条件时酶的识别位点专一性 下降的现象

部分酶切和完全酶切 酶的保存
思考题

对核酸进行限制性酶切时应注意什么？ 如何提高核酸电泳的分辨率？ EB染色的特点和注意事项是什么?

计算举例:
48502 /Marker DNA总量=同 等亮度条带的bp数/待测样品 的DNA量(ng)
不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性 DNA分子的有效范围
琼脂糖浓度/%
0.3 0.6
电泳
注意:务必记录点样顺序和点样量


接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正 负极) 恒压100V, 电泳40-60分钟 紫外灯下观察并记录结果 分析结果并鉴定样品纯度
大量酶切
无菌ddH2O
5xbuffer H (BSA) 质粒DNA EcoRI
43 uL
16 uL 16 uL 5 uL 总体积 80 uL
影响泳动速率的因素

电场强度
DNA在电泳条件下带负电荷，在电场作用下向正极泳 动

分子量大小与DNA构型
质粒三种构型的泳动速率：超螺旋 线型 开环
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
凝胶浓度 电泳缓冲液： TAE TBE（大于实际分子量） TPE
分子量标准

定义: 在电泳测定DNA样
品的分子量及浓度的 过 程中所使用的标准样品对 照.
分离范围/kb
5 - 60 1 - 20
0.7
0.9 1.2 1.5 2.0
0.8 - 10
0.5 - 7 0.4 - 6 0.2 - 3 0.1 - 2
实验材料

50xTAE buffer
6xLoading buffer（溴酚蓝+蔗糖） 琼脂糖 溴化乙锭, goldviewna DNA marker（DNA HindIII/EcoRI）
质粒DNA
EcoRI及其BufferH
实验仪器

琼脂糖凝胶电泳系统 电泳仪，电泳槽，制胶板、梳子


Restriction enzyme name, recognition sequence
Hind III RI
A|AGCTT CTGCA | G TTCGA | A G | ACGTC
Bam HI Pst I
G|GATCC CCTAG|G G | AATTC
Eco
CTTAA | G
Sticky end or

台式离心机
紫外透射仪
实验步骤



一、制胶 将制胶槽及梳子放入制胶模具 称取0.2g琼脂糖于三角瓶中, 加入20mL1xTAE , 加热至无颗粒状琼脂糖 冷却至65C加入goldviewna(0.5ug/mL) 2.0uL 摇匀,倒入制胶槽中待凝固 拔取梳子放入电泳槽中备用 倒入适量(80mL) 1xTAE buffer
星活性


限制性内切酶识别特异性放宽。
EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但 如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松 动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别 能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位 点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子 强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚 枫，二价阳离子，12%乙醇。
实验 质粒DNA的酶切
小量酶切:
无菌ddH2O 5xbuffer H (BSA) 质粒DNA EcoRI 总体积 13μL 4 μL 2 μL 1 μL 20 uL
混匀后,离心， 37°C酶切60分钟。
限制性内切酶

类型
I型 II型

III型
特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的特 殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在 此切割双链DNA。 多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸， 呈二元对称，少数识别更长的序列， 有的切割后形成平端，有的形成粘端。
cohesive end Eco RV
GAT | ATC
Blunt end

限制性内切酶
已经发现和鉴定了200多种 EcoRI 特 异 识 别 GAATTC及其互 补碱基组成的双 链片段 粘性末端 T4连接酶

酶单位定义：
酶反应条件：
缓冲体系（多酶切原则） 酶切温度 反应时间 DNA的
样品准备

质粒
1uL质粒 + 1uL Loading buffer 混匀

酶切样品
10 uL DNA/EcoRI+2 uL Loading buffer

DNA marker
5uL DSTM 5000 (- HindIII/EcoRI)
加样


每2人一块胶 每人上2个样品（质粒原液、酶切样 品） 每块胶一个Marker（5μL）


实验四
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
背景知识介绍

DNA的电泳分离技术是基因工程中的一项
最基本技术。

特点：快速、简便、样品用量少、灵敏度 高以及一次测定中可获多种信息
琼脂糖凝胶电泳

DNA、 RNA检测和分离的重要手段。 其分离是根据分子大小与构型形成的分 子筛效应

适于分离200bp-50Kb的DNA片段

[实验原理]
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场 中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应 和分子筛效应。 在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于 分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动 速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。

常用类型:
-HindIII, HindIII/EcoRI, PCR marker

选用的原则:
构型与被测分子相同 标准片段分子能包含被测分子 某些分子量标准使用前需要进 行预处理
-HindIII
-HindIII/EcoRI
[目的要求] 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度
的原理；
了解电泳过程中各因素对测定结果的影响； 掌握制胶、电泳、浓度测定的基本分析技术 。