第五章 蛋白质的复性
蛋白质的复性
为什么要进行蛋白质的复性？
外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产 物（ r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素等） 时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质 的活性。所以要进行蛋白质的复性。
1.什么是包涵体？ 2.为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli ）？
蛋白质复性
蛋白质复性的主要步骤：
破碎细胞
分离出包含体
溶解包含体
目标构建的构型复原。
包含体颗粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其
他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等.
蛋白质复性
Hale Waihona Puke 主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：
（1）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）
离心法提取出包含体
加变性剂溶解
除变性剂复性。
（2）机械破碎
蛋白质复性
预防包含体形成的方法 2. 通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性. 为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，人们在培养
条件的优化方面进行了多方面的探索。 （I）通过降低培养温度可以使人干扰素2和干扰素γ
的可溶性组分提高。这些蛋白在37℃下表达时以包 含体形式存在，当将培养温度降到23~30℃时,其可 溶性组分可达30%~90%。
蛋白质复性
包含体复性的方法
影响复性蛋白产率的因素： (1) 复性蛋白的浓度,为防止蛋白质分子间发生聚 集 , 复 性 蛋 白 的 浓 度 要 尽 量 稀 , 一 般 控 制 在 25-75 ug/mL为好. (2) 复性缓冲液要保持适当的氧化还原条件.一般 GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比为1为好. (3) 复性缓冲液的pH要通过实验来确定最适值. (4) 复性溶液中要加入适当的labilizing 试剂,如L 精氨酸,可提高复性产率.
蛋白质复性
预防包含体形成的方法 1. 形成分子伴侣
? 分子伴侣是什么
参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括：核质素，热休克蛋白 60 家 族 （ Hsp60 ） ， 热 休 克 蛋 白 70 家 族 （ Hsp70 ） ， 热 休 克 蛋 白 90 家 族 （Hsp90）和其他种类的分子伴侣
? 分子伴侣对新生肽链折叠的促进作用
蛋白质复性
包含体的溶解
包含体是不溶于水的，为了获得可溶性的蛋 白质，首先要使其溶解，通常用强的蛋白质变性 剂。对于不同的蛋白质可采用不同的方案，需经 实 验 后 确 定 。 一 般 可 用 5~8mol/L 尿 素 或 5~8mol/L的盐酸胍溶解包含体，使非共价聚集的 蛋白质分子间分离；当包含体内蛋白质多肽链中 含有半胱氨酸时,宿主菌破碎后,在空气的氧化作 用下,蛋白质分子内部和分子间及与杂蛋白分子间 可形成二硫键,该键是一种很强的键,为使蛋白质 充分溶解,也可用低pH值(pH7.2~7.05)加含巯基 的试剂(0.1%~1%)巯基乙醇或二硫苏糖醇和适量 的SDS(1%SDS),使蛋白质完全还原,呈溶解状态, 为蛋白质的复性作好准备.
有多种可选择的质粒；
重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；
蛋白表达量高（可达总蛋白50％）；
但原核表达系统也有一个问题，很多外源蛋白在E.coli细 胞内表达时往往以不溶的，无活性的包含体形式存在。若 能解决包含体问题，原核表达系统就可得到更广泛的应用。
蛋白质复性
现就包含体形成的预防、纯化、复性和测 定作一综述。
折叠促进剂
L-Arg, PEG, 去污剂, 尿素和盐酸胍
蛋白质复性
复性操作方法： 2.稀释和透析复性 稀释法：将溶液稀释，导致变性剂的浓度降 低，小分子折叠助剂浓度增大。蛋白质开始复性。 透析法：利用透析或电渗析超滤除去变性 剂，使蛋白质开始复性。 缺点：透析时间长，易形成蛋白质沉淀。
蛋白质复性
1.预防包含体形成的方法 2.包含体的纯化 3.包含体的溶解 4.包含体的复性
蛋白质复性
预防包含体形成的方法 由于包含体内的蛋白质是非折叠状态的聚 集体，不具生物活性，因此要获得具有生 物活性的蛋白质必须将包含体溶解，释放 出其中的蛋白质，并进行纯化、复性。近 年来人们已开始着手寻找各种方法去防止 包含体的形成。
蛋白质复性
蛋白质复性
包含体的形成
包含体（inclusion body,IB）是外源基因在原核细胞中表达时，尤 其在大肠杆菌细胞中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶 性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中的其他 成分有明显的区别。 包涵体的形成比较复杂，有些机理还不清楚； 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或 环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 (1)包含体的形成与细胞内蛋白质的生成速率有关，新生成的多肽浓 度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白 质的聚集体； (2)包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、 pH值、离子强度、氧化还原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有 关。 (3)大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响时，其本身蛋白质的 表达也可出现异常，造成蛋白质的聚集从而形成包含体。 (4)重组蛋白的氨基酸组成.一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体， 而 脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
蛋白质复性
包含体的形成 蛋白质的产量是折叠和凝聚竞争的平衡，蛋白质凝聚的 成因是由于重组蛋白分子之间的疏水作用，而疏水作用 也决定了凝聚物的浓度； 二硫键的形成则决定了凝聚物本身体积的大小。蛋 白质在折叠过程中，本应于分子内部的疏水区之间相互 作用、碰撞，形成不正确的的折叠而导致凝聚，从而形 成包含体。
蛋白质复性
包含体复性的方法
影响复性蛋白产率的因素：
(5) 复性温度也是一个影响因素,一般在低温下(410℃)进行. (6) 为防止聚集发生,复性时,可采取分步加入变性 蛋白的操作方法. 在溶液中变性-复性方法受各种因素的影响,且对 不同蛋白质所需的最适条件可能又不相同,因此对 于一个特定重组蛋白的复性要通过实验找出最适 条件.
流加稀释复性 复性液中蛋白质初始浓度=0.边流加、边 复性。故变性蛋白质浓度始终保持在较低 水平，有利于提高复性收率，且终浓度较 高。
蛋白质复性的影响因素
浓度
增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行
温度
蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（＞40℃） 蛋白质的聚集将十分严重
pH值
通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近
疏水键的相互 作用强度
蛋白质复性
包涵体形成的机制：

U←→I←→N
U：指完全去折叠的状态，
I：指折叠中间体（也称融球态 molten globule state）
N：指天然的成熟的状态
蛋白质复性
Mitraki和King提出了以下包涵体的形成模型：

IPf为可溶的、部分折叠的早期中间体 IPm未可形成单体的中间体 IPf*为形成包涵体的形式
①使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力； ②在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽 链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径
? 应用分子伴侣的策略
可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，GroES和 GroEL可显著提高D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）的折叠、 组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶A脱 氢酶的产量和组装效率；对可溶性β-葡萄糖苷酶的表达也有提高
蛋白质复性
包含体的纯化 含有包含体的大肠杆菌细胞膜的结构常
发生改变，脆性增加，故可利用一些简单 的方法使宿主菌释放出包含体。可用溶菌 酶、匀浆或超声波等酶法、物理学的方法 使细胞裂解。由于包含体密度高，可用短 时的低速离心（1000~12000g）将其与细 胞碎片等物质分离。
蛋白质复性
包含体的纯化 若采用密度梯度离心技术则可得到纯度较 高的包含体。如果得到的包含体含有较多 的杂质，可用含常用盐和去污剂 （TritonX-100）的溶液进行洗涤，使污染 的膜蛋白等杂质溶解，得到含杂质较少的 包含体。
蛋白质复性
蛋白质复性
路线2的特点：
方法（2）：应用膜分离技术，用微孔膜除去可 溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点： 可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污 染，耗能少。缺点：膜的堵塞和浓度极化常导致 可溶性蛋白质的滞留，这项技术问题较多。
蛋白质复性
路线3的特点： 方法（3）：所用试剂即可以破菌，又可以溶解 包含体。将两道工序合为一道，节省了设备和时 间，比前两者更适合实验室操作。 缺点：混有杂质，不易分离。
蛋白质复性
包含体的形成的优势 形成包含体对克隆基因的表达产物蛋白质具有保 护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解 不稳定的多肽，许多可溶性的重组蛋白质对这些 酶敏感，使得利用细菌作为表达宿主时受到限制， 然而隔离在包含体内的蛋白质可免受蛋白酶的降 解作用；此外对宿主菌有毒性的重组蛋白以无活 性聚集体的形式存在也可以降低对宿主菌的毒害 作用。
（III）改变培养基的渗透压、降低pH值等方法也可 以达到减少包含体的目的。通过优化发酵条件改 善基因表达产物的方法虽然可行，然而也需要对 具体问题进行具体分析、实验。
蛋白质复性
预防包含体形成的方法
3．通过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基 酸取代，来增加重组蛋白的可溶性。
此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性 受到影响。通过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷 电性质，减少蛋白分子之间聚集，从而防止包含 体的形成。 如上所述，多种因素影响外源基因的可溶性表达 。对于如何获得天然构象和活性的可溶蛋白质的 技术方法，目前均无统一的模式，只能通过具体 实验来确定。
优势: 包含体可避免被水解酶水解
蛋白质复性