变复性的过程E.coli 中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物。
生产研究中为了得到较高的目的蛋白的表达量，通常会采用较强的启动子(如λPL 、T7 或串联启动子) ,使外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10 %～50 %. 然而胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性 .绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚集成不溶的、无活性的包涵体形式, 极大地影响到后续的结构分析和活性研究工作, 开展对这些包涵体的复性工作已成为一个重要的研究方向。
包涵体是由蛋白质折叠中间体的聚集而形成的,任何影响中间体稳定的因素(如pH 值、离子强度、温度等) 都可导致包涵体的形成.包涵体形成原因1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
3. 重组蛋白所处的环境，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
蛋白复性的必要性细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
复性过程是变性蛋白的重折叠过程。
对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠（即变性溶解) ,然后采用合适的复性方法促进变性，蛋白再折叠进而恢复活性.一．包涵体的分离纯化①含包涵体的宿主菌细胞的破碎；②将破碎液离心除去可溶蛋白（9000r 15min 4℃），获得包涵体；③洗涤包涵体,以除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤，温和去垢剂TritonX-100等洗涤包涵体,然后离心（12000r 5min 4℃）取上清洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白。
二．包涵体的去折叠（即包涵体的溶解）极端pH值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体。
绝大多数是采用6 mol/ L 盐酸胍或8 mol/ L 脲并结合还原剂来溶解包涵体.高浓度的变性剂可能会严重破坏蛋白质的二级结构,产生不可逆变性,导致无法复性. 因此,包涵体溶解时要采用尽可能低的变性剂浓度。
三．复性由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。
对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
包涵体蛋白复性方法稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。
其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。
相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。
此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
影响复性效率的因素：1蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而，一般浓度控制在0.1-1mg/ml；如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能导致蛋白重新凝聚。
2. pH：复性缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0-9.0。
[12]3.此外，影响复性效率的因素还有：温度（温度高时蛋白质易发生凝聚）、变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
提高包涵体蛋白的复性效率1.氧化-还原转换系统对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。
最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG。
氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。
通常使用还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10：1—5：1。
2.添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。
如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。
蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。
浓度为0.4-0.6M L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度，可以抑制二聚体的形成。
3. 分子伴侣和折叠酶等分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。
4.其它提高复性率的策略还有许多，如：非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂Triton X-100、磷脂、等对蛋白质复性有促进作用；待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。
[五．复性效果的检测：检测方法1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
蛋白复性的流程透析法一、实验器材分析天平、烧杯、量筒、磁力搅拌器、pH计、透析袋、离心机二、试剂尿素、Tris-base、NaCl、浓HCl、GSH、GSSG、甘油、精氨酸、G250三、实验步骤1.8mol/l尿素溶解包涵体（从蛋白组取得），离心（12000r 4℃ 5min)，取上清2.用8mol/l尿素稀释包涵体到终浓度为0.5mg/ml，取10ul稀释后溶液与285ul G250显色，取5ul 1mg/ml的BSA溶液与285ul G250显色，通过对二者进行颜色对比确定稀释终点3.将稀释液装入透析袋中，稀释液与透析液按照1:20的比例进行透析，透析液依次为6mol/l尿素 pH8.6，4mol/l尿素 pH8.5，,3mol/l尿素 pH8.4，,2mol/l尿素 pH8.3，1.5mol/l 尿素 pH8.2，,1mol/l尿素 pH8.1，,0.5mol/l尿素 pH8.0,0mol/l尿素 pH8.0，每次换液至少透析6h.4.改变精氨酸的浓度再进行透析，将精氨酸的浓度从0.5mol/l降到0.25mol/l,从0.25mol/l降到0各透析一次5.对复性蛋白进行浓缩，将PEG20000撒在透析袋上，4℃浓缩到适合体积6.收集浓缩蛋白，并跑蛋白凝胶，对蛋白含量进行初步定量。
注意事项1.控制包涵体的浓度，不宜偏高或偏低，偏高蛋白易沉淀，偏低则浪费试剂。
其他物质的加入也必须控制比例2.透析液的pH对蛋白复性有较大的影响3.复性要在4℃进行，否则蛋白易积聚沉淀4.根据蛋白的稳定性确定透析液中是否需要加入EDTA等其他物质5.每次换液透析时间不得少于6h，否则会因为变性液去除速度过快导致蛋白聚沉加入试剂对复性的作用GSH/GSSG:氧化还原系统实际上给蛋白质形成的是一个还原环境。
正确形成的二硫键在这样的环境中还是有可能被还原的。
氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率加入浓度大于0．4mol／LTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率精氨酸：L-Arg抑制分子间作用，降低聚集体生成速度，有助于增加复性中间产物的溶解度甘油：稳定天然蛋白质的结构，促进正确折叠产物的生成试剂配方（1L体系）尿素/g GSH/g2mM/L GSSG/g0.2mMArg/g 甘油/ml Tris/g NaCl/g PH8mol/l尿素480 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.0 6mol/l尿素360 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.6 4mol/l尿素240 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.5 3mol/l尿素180 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.4 2mol/l尿素120 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.3 1.5mol/l尿素90 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.2 1.0mol/l尿素60 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.1 0.5mol/l尿素30 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.0 0mol/l尿素0 0 0 87.10 50 6.06 14.61 8.0 0mol/l尿素0 0 0 43.55 50 6.06 14.61 8.0 0mol/l尿素0 0 0 0 50 6.06 14.61 8.0。