木瓜汁中提取木瓜蛋白酶
一、粗酶制备（冻存、调整浓度）
1.蛋白质浓度（考xx蓝法）
二、纯化和固定化
1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；
2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；
3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；
三、纯度
1.快速蛋白质液相色谱；
2.非变性碱性蛋白质电泳；
四、酶活性
1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；
2.水解IgG检测特异性；
五、载体/相表征
亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；
双水相：
一、xx木瓜制备粗酶[1,2]
1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。

-20 ℃存放。

（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。

）
2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。

可省略。

3.
[1]NitsawangS,Hatti-
KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.
[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。