9种鱼、鸡、鼠、猪、兔、猴、牛、鸟、鸭、鹅 人体：口服、饲喂、吸入、注射 β-外毒素：哺乳动物有害 Bt近缘Bc（产生食物毒素、引起腹泻、呕吐、恶心） Ba（人、畜炭疽病和头部生病、肺损伤和肠道感染） Bti 溶液的伴孢晶体毒素对动物有毒 肠毒素
5、剂型
(1) 液剂: 普遍、方便 水剂、乳剂、油剂 (2) 可湿性粉剂: 主产品，保存、包装、运输方便 (3) 胶囊剂: 防止阳光、高温、干燥对芽孢和晶体 的破坏，又使毒性成分逐渐释放，保
问题
• 厂家多、规模小、质量难保证：2000-3000万 产值只有3-4家。 • 菌种剂型单一：只登记Btk 、Bti； • 生产水平相对落后，后处理简单： 碟片式分离 损失30%以上。 • 质检 • 提纯：向抗生素学习，现在8%，上20%就好。
十、应用
(1) 蔬菜 (2) 棉花 (3) 水稻 (4) 玉米、高梁、小麦 (5) 果树、茶叶、花卉 (6) 烟草和油料害虫 (7) 森林害虫 (8) 仓贮害虫 (9) 卫生昆虫
植物疫苗--Incide
禾本科杂草狗牙根中寄生细菌(• Clavibacter • xyli •
subsp.cynodontis)
构建遗传工程杆状病毒杀虫剂
杆状病毒杀虫需时较长，限制了它的商品价值 插入对昆虫有效的毒素、激素等基因,垂直传播
以蓝细菌等构建Bt杀蚊工程菌 蚊子：疟疾、黄热病、• 登革热和丝虫病等疾 病传播媒介，幼虫以微生物水藻和细菌为食
分子生物学
1、基因鉴定（cry/chi/vip/aii/ihnA/cyt) 2、克隆、表达 3、构建工程菌（细胞工程、基因工程） 4、转基因植物
工程菌研究
出发菌杀虫谱不广、毒力效价不高 细胞融合、基因重组
杀虫假单孢工程菌的构建
Bt菌: 在土壤中不稳定，难防治土壤害虫; 寿命短，需重复使用 荧光假单孢菌(P. fluorescens)：植物根围和土壤中常见的有益细 菌，对环境适应性强、同植物亲和性好、对人畜安全，不少菌 株还防病增产。 美国孟山都公司：HD-1 ICP基因整合到玉米根际菌上 荷兰植物保护研究所 美国的Mycogen公司：CellCap, 较长的持效期、防止紫外线对 ICP• 的破坏。M-Trak和M-peril 中国农科院植保所：荧光假单孢菌P303，防治禾谷类全蚀病。 美国威斯康辛大学：整合到植物根部和叶部的定居菌洋葱假 单孢(P. cepacia)
France: Pasteur Institute Dr. de Barjac
Vegetative cell of Bacillus thuringiensis
Spore and parasporal crystal
spore
Crystal
Crystal diversity of B. thuringiensis
中国发展史
1941： 蒲蛰龙 菜青虫 解放初 ：孟雨 法国 1955：曹骥 法国商品分离、Lab杀虫 1959 ：张履鸿(苏)刘崇乐(福州人)捷克-玉米螟 1961： 彭中允 (苏) 1965 武汉、长沙生产 1986- 攻关、火炬、技改、863、973 改革开放为生物工程发展提供了机遇！
Activity spectrum of B.t.
1、原理和要求 总原则：代谢速度低，又不失活。• 低温：液氮、冷冻 隔氧：石蜡油 干燥：砂土管
2. 方法
(1) 砂土管：简单，不易污染 (2) 冷冻干燥：美国农业部 Brownsville Lab (3) 滤纸条：法国Pasteur研究所 (4) 液体石蜡斜面法：日本九州大学 (5) 菌膜保藏法： 便于邮寄，使菌种 保藏微型化
八、生态学和地理分布
1、地理区域
日本：发源地，广泛分布 美国：主要分布东部和东南部，类似于中国， 该地区是农业比较发达的地区。 中国：十分丰富。集中东北、华中、• 华东、 华南，西部和西北分离数较少。 生Βιβλιοθήκη 多样性：澳大利亚、新西兰、丹麦、越南
2、地理环境
(1) 饲养昆虫 (2) 贮藏产品 (3）土壤 (4) 植物体表面
两大难题需予克服:一是有效性，二为安全性 蓝细菌(Cyanobacterium)：一种生活在水体表 面，• 对营养要求不高，容易为蚊子幼虫摄食 的光能细菌。一些种能适应淡水和盐水环境， • 对温度耐性亦较宽。它们容易用染色体或质 粒转化，外源基因的表达载体亦已构建。
以枯草杆菌和其它芽孢菌 构建的工程菌
未来的路在延伸
资源：新基因 集合各种优势，构建多功能工程菌 转基因植物的扩大 发酵水平的提高 各种酶的研究和利用 代谢途径的了解 功能基因组学、蛋白质组学
cry1Aa cry1Ab cry1Ab /cry1C cry1Ac
cry1C cry2A cry3A
cry9C
Transgenic cotton
Transgenic corn
Transgenic forest
四、 分类及命名
1、鉴定及分类
(1) 生理生化：碳源、氮源、酶、代谢物 (2) 酯酶电泳 (3) H抗原: 德语Hauch(扩散) 英、日、美、法4位专家建议 (1982)--H.• de Barjac博士(法国) (4) PCR
1901 Lepidopteran
1977 Dipterans
1980s Colepterans, nematodes 1990s Mites, protozoa 1998 tumor cell
二、 形态特征及生理生化
1、形态特征 周鞭(无鞭)、G+、H抗原、O抗原 芽孢: 石碳酸复红、孔雀绿 芽晶: 芽孢高抗逆，菌株保存方式 晶体典型为菱形、也有圆形、方 形、椭圆形、不规则形，1个（几 个)毒素、无毒
与发展新型杀虫剂相比，投资较少。
Bt基因的表达和修饰
原核生物基因表达调控系统具有原核生物特性， 真核生物不能识别和运用这套表达调控系统 Bt毒蛋白基因在转基因植物中的表达与其长度有关 mRNA不稳定和翻译效率低 基因修饰
置换核苷酸残基
广泛修饰：66.6％密码子第三位的A或T碱基被G或 C• 取代
密码子偏爱(codon preference)
杀虫防病多功能工程菌
未来：
杀虫、抗病、除草、增产、固氮
植物抗虫基因的显著优点
育种期限短，目的性强 连续性保护，任何时期作用，避免反复多次 喷洒农药，不受气候影响和环境干扰 仅对取食转基因作物的那些害虫才有效，对
非靶生物没有影响
抗虫物质只存在于植物体内，在土壤和地下
水中无残留，不存在环境问题。
能保护那些难以喷洒到的植物部位如根部
3、机构
美国：Ecogen公司：9000株
农业部Brownsville Lab，HD-X系列 Ohio州立大学，大量突变株。 法国：巴斯德研究所（WHO昆虫病原细菌参考 中心）3500株 英国：温室作物研究所H.Burges博士HB-X系列 日本：九州大学Aizawa和Ohha博士、北海道大学 IIZUKA• 教授 国内：华中农大、中国林业科学院、湖北农科院、 中科院武汉病毒所、南开大学、福建农大
疟原虫
cry4A, cry4B, cry11A, cyt1A subsp. isrealensis
Dipterans
novel toxin genes:
cry5, cry6, cry7, cry8, cry1Ea
mites, nematodes, protozoa
Meloidogyue sp.
Used genes for transgenic plants
六、菌种选育
高毒力 良好的发酵和生产性能 对原材料的要求 生产稳定性 退化 现有菌株 育种技术
七、菌种保藏
2004.2.15. 100多位世界微生物专家齐聚北京，在“21 世纪微生物资源中心的使命”的国际学术研讨会 上达成共识：建立全球共享的微生物资源中心是 大势所趋。 微生物菌种保藏专门机构：59个国家 菌种保藏中心：495个，90万余株。美国的ATCC （综合最大， 12万株）。美国农业部的NRRL （最大农业微生物菌种中心，8万株）。中国农业 微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 仅3000多株。
大部分δ-内毒素偏爱的氨基酸密码子往往是植物 最不喜爱的密码子，尤其是在GC• 含量极高的单子叶 植物如玉米。因此，Btδ-内毒素基因中密码子用法的 改造会导致单子叶植物和双子叶植物上异源基因表达 的增强。
问题
工程植物的安全性 基因的表达量 基因的定位表达 昆虫的抗性•
2、命名
(1) 采集地: 苏云金、肯尼亚、以色列、九州、
2、生理生化: 要求不高。 碳 源: 淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖 N 源: 牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、 豆饼粉、鱼粉、玉米浆 无机盐: K2HPO4、MgSO4、CaCO3。主要元素 有磷、硫、镁、钾、钠、钙，微量元素锰、 锌、硅、铁，所需甚微，水杂质即可满足， 多了有毒。 温 度: 10-40℃，28-32℃适。 pH：微碱性条件 氧: 好氧 紫外线 抗生素及化学物: 放线菌素D、氯霉素、红霉素。 乳化剂抑制 发酵工程的前提
几丁质酶 卵磷酯酶C
多元醇类 双效菌素
脊椎动物门 半索动物门 腕足动物门
癌细胞
节肢动物门
鳞翅目 双翅目 鞘翅目 膜翅目 螨类 等9个目
环节动物门 苔藓动物门 软体动物门 植物线虫 线虫动物门
活 性 谱
棘皮动物门
动物线虫
丝虫
纽形动物门
腹毛纲 轮虫纲
扁形动物门
海绵动物 原始后生动物
血吸虫,肺吸虫
原生动物
护剂可防止紫外辐射的伤害
我国Bt现状
80家，139个产品，产量4万吨 应用 5000-6000 万亩次，复配 48 家，登记产 品74个，106个厂、213个产品 山东：24 河南：7 湖北：7 福建：6 山西：6 有机食品论证：Bt已通过，阿维菌素不行