操作一览(PT3000-2)本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。

A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：1–3 μl RNA 样本(对照反应，使用1 μl 的对照RNA)1 μl SMART™ IV Oligonucleotide1 μl CDS III/3' PCR Primer如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。

2. 混匀试剂并瞬时离心。

3. 72°C孵育2 min。

冰上冷却2 min。

4. 瞬时短暂离心。

5. 向每管反应中加入以下试剂：2.0 μl 5X First-Strand Buffer1.0 μl DTT (20 mM)1.0 μl dNTP Mix (10 mM)1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase10.0 μl 总体积6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

7. 42°C孵育1 hr。

之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。

8.引物延伸合成ds cDNA分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。

B. LD PCR扩增合成cDNA1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)80 μl Deionized H2O10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer2 μl 50X dNTP Mix2 μl5' PCR Primer2 μl CDS III/3' PCR Primer2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix100 μl总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

3. 如果需要可以向管中加2滴矿物油，盖上管盖，置于预热(95°C)的PCR仪器中。

4. 以下程序选择一种进行扩增：GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600•95℃ 1 min •95℃20 sec•x cycles*: •x cycles*:95℃15 sec 95℃ 5 sec68℃ 6 min 68℃ 6 min*参考Table I 中最优循环数的使用。

5. 取5μl产物在1.1% 琼脂糖/EtBr 胶上进行检测，若检测结果与预期不符时，请参考疑难解答指南(说明书的Section VIII)。

6. 然后进入步骤D。

C. 引物延伸扩增ds cDNA1. 混匀以下试剂：11 μl First-Strand cDNA (from Step A.8)71 μl Deionized H2O10 μl10X Advantage 2 PCR Buffer2 μl dNTP Mix2 μl5' PCR Primer2 μl CDS III/3' PCR Primer2 μl 50X Advantage 2 Polymerase Mix100 μl 总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

3. 如果需要可以加2滴矿物油，盖上管盖后置于预热(95°C)的PCR仪器中。

4. 以下程序选择一种进行扩增：GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600• 72°C 10 min • 72°C 10 min• 95°C 1 min • 95°C 20 sec• 3 cycles:• 3 cycles:95°C 15 sec 95°C 5 sec68°C 8 min 68°C 8 min5. 取5μl产物在1.1% 琼脂糖/EtBr 胶上进行检测，如果结果与预期不符，请参考疑难解答指南(说明书的Section VII)。

D. 蛋白酶K 消化1. 向0.5-ml 无菌管加入50 μl 扩增后的ds cDNA(2–3 μg) 和2 μl 蛋白酶K (20 μg/μl)。

将剩余ds cDNA置于–20°C保存。

2. 混匀试剂并瞬时离心。

3. 45°C孵育20 min，瞬时离心。

4. 加入50 μl Deionized H2O。

5. 再加入100 μl 酚:氯仿:异戊醇，轻柔地连续颠倒1–2 min。

6. 14,000 rpm 离心5 min。

7. 将最上层液体(上清液) 转移到0.5-ml干净的管。

8. 加入100 μl 酚:氯仿:异戊醇，轻柔地连续颠倒1–2 min。

9. 14,000 rpm 离心5 min。

10. 将最上层液体(上清液) 转移到0.5-ml干净的管。

11.加入10 μl 3 M醋酸钠, 1.3 μl 糖原(20 μg/μl)和260 μl室温95% 乙醇，立即进行14,000 rpm 室温离心20 min。

12. 小心去除上清液。

13. 100 μl 80%乙醇清洗。

14. 空气干燥(~10 min)来挥发残留的乙醇。

15. 加入79 μl Deionized H2O 重悬DNA颗粒。

E. SfiI 酶切1. 在0.5-ml离心管中混匀以下试剂:79 μl cDNA (Step D.15)10 μl 10X Sfi Buffer10 μl SfiI Enzyme1 μl 100X BSA100 μl总体积2.混匀并在50°C 孵育2 hr。

3. 加入2 μl 1%二甲苯腈蓝，混匀。

F. CHROMA SPIN TM-400 cDNA分选1. 标记16个1.5-ml离心管，按顺序摆放在管架中。

2. 准备CHROMA SPIN-400纯化柱：a. 室温放置CHROMA SPIN 纯化柱1 hr。

然后颠倒数次混匀胶质。

b. 赶走纯化柱中的气泡，使用1000-μl 移液器轻柔地重悬胶质。

去除底盖让液体滴落。

c. 将纯化柱放置在环形支架上。

d. 借助重力将柱中存储液排干(胶质的顶端应该处于柱外表面1.0-ml标记处。

)e. 流速~1滴/40–60 sec，每滴体积~40 μl。

3. 当存储液排干后，加入700 μl 柱纯化缓冲液并将其排干。

4. 向胶质中央加入~100 μl SfiI消化后的cDNA和二甲苯腈蓝混合液(Step E.3 above)。

5. 当样本被胶质完全吸收后再进行下一步骤。

6. 向胶质中央加入100 μl缓冲液清洗纯化柱。

7. 排干缓冲液，胶质表面不能有液体残留。

当无液体滴落时，再进行下一步骤。

8. 将步骤1中离心管放置在纯化柱下方，使标记1的管对准纯化柱下方液体出口处。

9. 加入600 μl 缓冲液后立即使用管1–16分别收集连续的1滴液体（每管~35 μl）。

10. 从16管中各取3 μl 在1.1% agarose/EtBr gel上150 V.电泳10 min检测分析。

将最能代表实验样本cDNA大小范围的头3-4滴所对应管中的样本合并到一管。

11. 向管中加入以下试剂：1/10 vol. Sodium Acetate (3 M; pH 4.8)1.3 μl Glycogen (20 mg/ml)2.5 vol. 95% ethanol (–20°C)12. 前后轻柔地摇晃管使试剂混匀。

13. –20°C或干冰/乙醇中放置1 hr。

14. 14,000 rpm室温离心20 min。

15. 小心吸掉液体。

16. 短暂瞬时离心。

17. 小心洗掉液体，然后空气干燥~10 min。

18. 加入7 μl Deionized H2O重悬DNA颗粒。

G. cDNA 连接载体1. 标记3个0.5-ml 离心管，并向管中分别加入表(Table II)中所列试剂。

混匀并瞬时离心。

2. 16°C孵育过夜。

3. 分别进行λ-phage 包装。

4. 对文库进行滴度测定(Section H)。

3个连接体系可获得1–2x10e6个单克隆。

未扩增的文库在4°C 可保存2 weeks。

5. [可选]如果文库<1–2x10e6克隆，可将剩余的cDNA进行连接载体。

使用表中cDNA和载体比例重复连接反应能够收获最好的结果；也可以根据cDNA的使用量来扩大体系来做连接。

再进行包装反应和滴度测定实验。

若这时候滴度还是低的话，请参考说明书中Section VIII的疑难解答指南。

6. 为了提高文库的稳定性，首先将步骤G.4中包装反应物合并，然后参照步骤J对文库进行扩增。

扩增后的文库4°C可放置6–7 months，或在–70°C (in 7% DMSO) 可放置1年。

H. 测定未扩增文库的滴度1. 从存储培养板板中选取单个宿主菌株，接种到50-ml含15 ml LB/maltose/MgSO4液体培养基的实验管。

37°C震荡(140 rpm)孵育过夜。

当OD600 o=2.0时，5,000 rpm离心5 min收集菌体。

弃上清，用7.5 ml 10 mM MgSO4.重悬菌体。

2. 准备90-mm LB/MgSO4 固体培养板，37°C预热培养板。

3. 使用1X lambda dilution buffer(稀释度=1:5-1:20)稀释未扩增细胞裂解物。

4. 向过夜培养的200 μl XL1-Blue中加入1 μl 稀释后的噬菌体，37°C作用10–15 min。

5. 加入2 ml 融化的LB/MgSO4 顶层琼脂，快速混匀，立即铺于90-mm 37°C预热的LB琼脂板上。

6. 将培养板室温冷却10 min，37°C 倒置培养6–18 hr。

7.记数菌斑，并计算噬菌体滴度(pfu/ml):I. 鉴定重组率通过感染合适的宿主菌株(例如，E. coli XL1-Blue)和蓝白斑筛选，可鉴定含有插入片段的噬菌体。

参照未扩增文库滴度测定的步骤(Step.H)来进行蓝白斑筛选，步骤中还需增加的实验是：在铺板噬菌体+细菌混合物时，向融化的顶层琼脂中加入IPTG 和X-gal。

2 ml融化的顶层琼脂使用50 μl IPTG、50 μl X-gal存储液。

为了获得500–1,000菌斑/90-mm板，将培养板在37°C 孵育6–18 hr。

白斑和蓝斑的比例可以快速直观的估算重组效率。

成功的连接实验的重组率为80%。

如果您获得的重组率小于这个值，请参考说明书Section VIII的疑难解答指南。

[可选]SMART™ PCR cDNA 文库的PCR插入片段筛选检测连接效率，推荐使用Clontech的Advantage 2 cDNA PCR Kit和λTriplEx LD-Insert Screening Amplimers 检测cDNA插入片段。