第31卷第2期2010年3月西安交通大学学报(医学版)J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Scie nces )V ol.31No.2Mar.2010◇技术方法◇核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择张富军,任 娟,王飞苗,吕社民,李冬民(西安交通大学医学院遗传学与分子生物学系,陕西西安 710061)摘要:目的 探讨不同抗原修复法对DA.1U 大鼠肝组织内核受体检测结果的影响。
方法 应用微波修复法、高压修复法、酶修复法和高压加酶修复法对DA.1U 大鼠肝组织切片进行修复,然后进行免疫组化染色。
结果 DA.1U 大鼠肝组织内核受体L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 经高压抗原修复后,染色阳性强度较其他修复方法明显增强,而且定位较佳。
结论 在核受体免疫组化染色中高压抗原修复法染色效果优于其他抗原修复法。
关键词:核受体;免疫组织化学;抗原修复中图分类号:R329233 文献标志码:A 文章编号:167128259(2010)022*******Selection of antigen retrieval methods in immunohistochemicalstaining of nuclear receptorsZHAN G Fu 2jun ,REN J uan ,WAN G Fei 2miao ,L ΒShe 2min ,L I Dong 2min(Depart ment of Genetics and Molecular Biology ,Medical School ofXi πan Jiaotong University ,Xi πan 710061,China )ABSTRACT :Objective To explore t he eff ects of diff ere nt met hods of antige n ret rieval on t he results ofimmunohist ochemical staining of nuclear recep t ors.Methods A ntige ns were ret rieved by using microwave oven ,aut oclave ,e nzyme and aut oclave plus e nzyme ,respectively ,in liver sections f rom DA.1U rats ,f ollowed by immunohist ochemical staining.Results Af ter a ntige n ret rieval wit h aut oclave ,t he p ositive staining inte nsity ofnuclear recep t ors L XR 2α,L XR 2β,PPAR 2γa nd F XR in t he liver sections f rom DA.1U rats was enhanced obviously ,a nd t he location of nuclear recep t ors was better by using t his met hod t han t he ot hers.Conclusion In t heimmunohist ochemical staining of nuclear recep t ors ,using aut oclave t o ret rieve a ntige ns is t he best met hod.KE Y WOR DS :nuclear recep t or ;immunohist oche mical staining ;a ntige n ret rieval收稿日期:2009202224 修回日期:2009203229基金项目:国家自然科学基金(No.30400249,30571725,30630058);陕西省国际合作项目(No.20072kw 206);陕西省自然科学基金项目(No.2004C256)Supported by t he National Natural Science Foundation of China (No.30400249,30571725,and 30630058),Interna 2tional Cooperation Foundation of Shaanxi Province (No.20072kw 206)and t he Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2004C256).通讯作者:李冬民.E 2mail :lidongm @ 作者简介:张富军(19632),男(汉族),实验师.E 2mail :zfj @ 核受体在生物体内广泛分布,与配体结合后活化,调控基因的表达,在机体生长发育、新陈代谢等生理过程中发挥重要作用。
核受体L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 在糖、脂代谢调控中起重要的作用,参与2型糖尿病的发生发展。
免疫组织化学染色是根据抗原与抗体特异性结合的原理,用标记的特异抗体对组织细胞内抗原进行定位、定性及定量研究。
甲醛溶液固定导致许多抗原决定簇被掩盖,不能与抗体很好结合。
核受体位于核内,镜下观察染色结果时,若隐若现,抗原表达不均匀。
为了解决该问题,使抗原决定簇能很好的暴露出来,我们采取了微波修复法、高压热修复法和酶修复法等。
抗原修复方法对DA.1U 大鼠肝组织切片进行修复;比较分析不同抗原修复法对DA.1U 大鼠肝组织内核受体免疫组化染色结果的影响。
1 材料与方法1.1 仪器与试剂 Olymp us DP71图像分析仪。
L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 抗体购自Abcam 公司;免疫组化(SP 法)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 组织材料 病理切片来自DA.1U 大鼠糖尿病模型肝组织,经40g/L 多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,5μm 厚,每个蜡块各切5片。
1.3 抗原修复 组织切片常规脱蜡至水,3%(体积分数)H 2O 2灭活内源性过氧化物酶,0.02mol/L2期张富军,任 娟,王飞苗,等.核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择PBS 冲洗后抗原修复。
1.3.1 微波修复法 将切片插入塑料切片架,放置于盛有150mL 0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液(p H 6.0)的容器中,置微波炉内加热1min 40s ,使缓冲液温度保持于82℃以上。
取出切片架,室温放置3min ,然后将切片架置于凉水中冷却15min 。
1.3.2 高压修复法 将切片插入金属架,放置于盛有400mL 0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液(p H 6.0)的烧杯中,将烧杯放入高压锅内,盖锅、压阀。
待煮沸喷气后,计时2～3min ,然后将压力锅端离电炉,自然冷却20min 后取出切片。
1.3.3 酶修复法 将复合消化液滴加于切片组织上并完全覆盖,将切片放入湿盒内,37℃温箱中消化10min 。
1.3.4 高压加酶修复法 按上述方法高压修复后取出切片,蒸馏水冲洗,PBS 洗2min ×3次后,将复合消化酶滴加于切片组织上并完全覆盖,将切片放入湿盒内,37℃温箱中消化3min 。
1.4 免疫组织化学染色 经上述步骤处理后的切片均用PBS 冲洗3次,各5min ;滴加正常动物血清封闭液,室温放置20min ,甩去多余液体;每张切片滴加Ⅰ抗30μL ,4℃过夜,次日37℃复温45min ,PBS 冲洗2min ×3次;每张切片滴加生物素标记Ⅱ抗30μL ,37℃20min ,PBS 冲洗5min ×3次;滴加链酶亲和素2过氧化物酶复合物,37℃20min ,PBS 冲洗5min ×3次;DAB 2H 2O 2显色,在显微镜下控制染色程度,自来水冲洗10min ;苏木素复染。
以PBS 替代Ⅰ抗作为阴性对照。
2 结 果核受体L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 均表达于核内,以核内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性。
对4种核受体抗原采用4种抗原修复方法,以PPAR 2γ为例说明(图1):①阴性对照,未见特异性免疫染色,肝细胞核均被苏木素染为蓝色;②不修复,可见肝细胞核均为蓝色,未见棕色颗粒;③微波修复,在少数肝细胞质中出现棕色颗粒,核仍为蓝色,定位不准确;④酶修复,采用复合消化液修复肝组织后,细胞核未被染色;⑤高压修复,该法修复肝组织切片后,染色强度明显强于其他修复法,而且背景清晰;⑥高压加酶修复,通过该法修复后,肝组织染色强度强,但是组织碎裂,且背景深。
L XR 2β免疫组化染色结果见图2。
图1 不同抗原修复方法对核受体PPAR 2γ免疫组化染色结果的影响Fig.1Effect of different antigen retrieval methods on immunohistochemical staining of nuclear receptorPPAR 2γ(SP ,×400)A :阴性对照;B :不修复;C :微波修复;D :酶修复;E :高压修复;F :高压加酶修复。
352 西安交通大学学报(医学版)第31卷图2 高压修复法对核受体L XR2β免疫组化染色结果的影响Fig.2Effect of antigen retrieval by autoclave on immuno2 histochemical staining of nuclear receptor L XR2β(SP,×400) A:不修复;B:高压修复。
3 讨 论甲醛固定时,蛋白质的自由氨基与醛基形成羧甲基,或蛋白质氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键,使得蛋白质抗原决定簇部分被封闭,无法表达出来,影响免疫组化的结果[1]。
抗原决定簇是否充分暴露,是决定免疫组化结果的关键因素。
为了更好地暴露抗原,目前世界公认的方法就是进行抗原修复。
抗原修复方法主要包括热修复和酶修复。
高温抗原修复方法机理复杂,高压可使交联断裂或折叠的肽链解开,从而暴露抗原决定簇[2];微波场内离子或极性分子直接碰撞,使扭曲、折叠的异常结构恢复正常[3]。
热修复法比较稳定,因高压修复法避免了外界环境对温度的影响,在染色强度和重复性方面优于微波修复法[4]。
酶修复法则是通过溶解抗原表面的变性蛋白使之暴露,但是酶消化时间因组织不同而异,不易控制,结果不稳定。