显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部
位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗 原是否存在。 通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜 下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在 与否。
2. 免疫组织化学染色的显色原理
(1) 基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其 中以酶标抗体法应用最为广泛。
3. 组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋
（1）脱水 脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常 用酒精。 酒精可以与水以任何比例混合，脱水能力强， 并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度很快，对组 织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，应 从低浓度开始，然后再依次增加其浓度。在常温下 或4 º C下进行，以减少抗原的损失。 70% 80% 90% 95% 100% 100%
（3）浸蜡
组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程 称浸蜡。 为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡 浸渍。
用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温 蜡，在60 º C以下浸透。
（4）包埋
浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡 到入包埋盒，冷却后取出，修块。
4. 石蜡切片的制作 （1）载玻片涂片的制作 防 脱 片 剂 ： 3- 氨 基 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 （ 3aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚赖氨 酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明胶。 APES 涂片的制作 原理： APES 是一种新型玻片粘附剂，与一般 的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰 作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片 牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。 具体操作方法： 将载玻片用酸处理后，用95%酒精浸泡，再用 绸布擦干，清除表面的污渍；
（2）水洗
冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定 时 间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗 24 小时，小动物组织冲洗2-10小时。 新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短， 固 定时间长的标本，冲洗时间也需延长。 冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并 扎 紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一 端
（二）各染色步骤的具体操作及注意事项
1. 组织材料的采取
活检组织 组织标本 手术切除标本 尸检标本 实验组织或培养细胞 活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织 体积小，因活检钳直接钳取，常受压过度而变性，因此， 活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的 病灶区。 抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑 切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。

2. 组织块的固定、水洗
（1）固定液：种类较多，常用的有以下2种： 4% 甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法： 10 ml 40% 甲醛 (formalin) + 90ml PBS 使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)， 还可形成甲酸，影响染色结果。(可以用粉笔溶) 4% 多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB (pH 7.2-7.4)，搅拌、加热至60 º C，同时滴入1N NaOH 至溶 液完全透明。冷却后用1N HCl 调PH 值至7.2-7.4，再用0.1mol/L PB将溶液加至1000ml。 ¶ 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。 ¶ 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。 甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。 ¶ 不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的 抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。
直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与
切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色， 显示出所检测的目的抗原的部位。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和
性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特 异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠 制备的单克隆抗体。
（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP + H2O2 HRP ·H2O2 HRP ·H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O
HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是 非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使 反应的终产物呈现不同的颜色，如： CN为蓝色 TMB为深蓝色 AEC为红色 DAB为棕色
一、免疫组织化学染色方法的原理
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能： （ 1 ）免疫原性（ immunogenicity ） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。 （ 2 ）反应原性（ reactogenicity ）指抗原分子与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸盐）为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。 ALP 标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高 的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。 由于组织细胞内含有内源性 ALP ，在显色液中需加入 终浓度为 2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性 ALP活性可被抑制。 葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD ) 以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为-D-葡萄糖67mg、 NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37º C孵育1小时， 生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片 可经脱水、透明后封片，长期保存。
第三节 免疫组织化学染色步骤
（一）ABC或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤 1. 组织材料的采取； 2. 组织块的固定； 3. 组织块的脱水、透明及石蜡包埋； 4. 石蜡切片的制备； 5. 石蜡切片的脱蜡及水化； 6. 抑制内源性过氧化物酶活性； 7. PBS洗涤切片； 8. 抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原； 9. PBS洗涤切片；
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。 IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。 （2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体） 孵育切片 发色剂显色 （核复染）
二、光学显微镜下的组织学染色方法
• 常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） • 组织学特殊染色 1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、 细胞DNA和RNA的染色等 上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的 形态改变。
10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时 加入BSA）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附； 11. 用特异性一抗(单克隆、多克隆)孵育切片； 12. PBS（可加入Tween 20#，PBST）洗涤切片； 13. 用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片； 14. 用PBS或PBST洗涤切片； 15. 滴加SP试剂或ABC试剂； 16. PBS或PBST洗涤切片； 17. DAB或AEC显色； 18. 自来水洗涤切片，终止显色； 19. 用苏木素做核复染； 20. 切片脱水、透明，树胶封片。
三、超微结构的观察
• 光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。 • 电镜的分辨率最佳可达 0.14nm ，放大倍率最高可达 100 万倍。
第二节 免疫组织化学染色技术
Immunohistochemical technique
该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构 或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫 细胞化学技术。 根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术
2. 抗原的分类
完全抗原、半抗原
免疫学分类
胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿 瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、 血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物 等之间存在的共同抗原
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B 淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。 大部分抗体电泳后位于 区带， 1972 年国际免 疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋 白分子统一命名为免疫球蛋白 (immunoglobin ， Ig) 。
免疫组织化学染色技术
第一节 常规组织学染色技术概述
宏观 微观 超微结构 基因水平 组织形态学研究技术的种类： 一、病理大体组织标本的染色方法
在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标 本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本 进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不 同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特 点，如： 脂肪组织染色法 目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥 样硬化大体标本的染色